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描述

Inoue法是一种制备超感受态大肠杆菌的高效方法，由Inoue、Nojima和Okayama于1990年发表在《Gene》杂志上（Gene 96:23-28）。该方法通过在低温（18°C）下培养细菌，并使用特定的转化缓冲液（TB），可获得高达1×10^9 CFU/μg DNA的转化效率，适用于质粒DNA的高效转化。

操作步骤

1. 从LB平板上挑取单菌落，接种于LB培养基中，37°C振荡培养过夜。

2. 将过夜培养物按1:100稀释至250 mL SOB培养基中，18°C振荡培养至OD600 = 0.6。

3. 将培养物置于冰上冷却10分钟。

4. 4°C下2500×g离心10分钟（Sorvall GSA转子5000 rpm，或Beckman J-6B转子3000 rpm）。

5. 弃上清，用80 mL冰预冷的TB缓冲液轻轻重悬菌体。

6. 冰上放置10分钟。

7. 4°C下2500×g离心10分钟（Sorvall GSA转子5000 rpm，SS-34转子5500 rpm，或Beckman J-6B转子3000 rpm）。

8. 弃上清，用20 mL冰预冷的TB缓冲液轻轻重悬菌体。

9. 加入DMSO至终浓度7%（即1.4 mL），轻轻混匀。

10. 冰上放置10分钟。

11. 分装至1-2 mL离心管中，液氮速冻。

12. 保存于液氮中备用。

培养基与缓冲液配方

SOB培养基：2%（w/v）胰蛋白胨，0.5%（w/v）酵母提取物，10 mM NaCl，2.5 mM KCl，10 mM MgCl2，10 mM MgSO4。

TB缓冲液（转化缓冲液）：10 mM PIPES，55 mM MnCl2，15 mM CaCl2，250 mM KCl。用5N KOH调pH至6.7（加入MnCl2之前调pH）。

注意事项

1. 所有操作需在无菌条件下进行，避免污染。

2. 细菌培养温度严格控制在18°C，低温是获得高转化效率的关键。

3. 重悬菌体时动作要轻柔，避免机械损伤。

4. DMSO需在冰上加入，并迅速混匀。

5. 感受态细胞应分装后立即液氮速冻，长期保存于液氮中，避免反复冻融。