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本文详细描述了利用粘粒载体构建植物基因组文库并进行筛选的完整实验流程。该文库基于L. pennellii（一种番茄野生种）构建，使用MboI部分酶切总基因组DNA，经蔗糖梯度离心筛选15-30 Kb片段，连接至双元粘粒载体T04541。该载体含有左右边界序列、植物选择标记NPTII基因及细菌四环素抗性标记。

滴度测定：将菌液在LB培养基中从10⁻¹稀释至10⁻⁶，各取10 μl涂布于90 mm四环素平板，37℃过夜培养后计数菌落。计算在140 mm平板上约产生4000个菌落的稀释度用于后续实验。

涂板与菌落复制：按滴度将菌液涂布于140 mm LB-四环素平板，倒置培养12-14小时（37℃）。2-3天的平板因吸收接种物更佳，使用前于4℃预冷30-60分钟。用软铅笔标记硝酸纤维素滤膜，在平板上不对称刺孔标记。将滤膜（编号面朝下）贴于菌落上2分钟至完全湿润，揭起后菌落面朝上置于1 ml变性液（0.5 N NaOH, 1.5 M NaCl）的Saran Wrap上2分钟，重复一次。随后转移至1 ml中和液（1.5 M NaCl, 0.5 M Tris pH 7.4）2分钟，重复一次。最后在2×SSC中浸泡5分钟，菌落面朝上置于干燥3MM纸上室温干燥至少30分钟。母板于37℃培养5-7小时使菌落再生，并重复一次滤膜转移以制备重复膜。母板用Parafilm密封，4℃倒置保存。

杂交与结果读取：滤膜与³²P标记探针杂交，洗涤后曝光X光片。将胶片与滤膜对齐，标记不对称点位置及阳性杂交信号。通过比对胶片与琼脂平板上的标记点识别阳性菌落。

第二轮筛选：用移液器吸头反面挑取阳性菌落（连带琼脂），接种于2-3 ml LB（含适当抗生素）37℃培养数小时。若无法精确定位单个菌落，可混合相邻菌落。将10⁻¹、10⁻²、10⁻³稀释液各10 μl涂布于90 mm LB平板，37℃过夜培养。随后将菌落划线至含50个隔离位置的LB平板，37℃过夜培养。重复杂交筛选，从第二轮中挑取单个分离良好的阳性克隆用于后续分析。