描述 该文库为L. pennellii文库。粘粒文库由MboI部分消化的总基因组DNA构建，经蔗糖梯度分级分离，选择约15-30 Kb的片段。DNA被连接到粘粒载体T04541中。该载体是一种双元载体，具有左右边界序列和用于植物筛选的NPTII基因，同时带有四环素标记用于细菌筛选。 步骤 1. 挑取一个单菌落，接种到10 ml LB培养基（含适当抗生素）中，培养6-8小时。
2. 将培养物转移至1升LB培养基（含抗生素）中，37°C振荡过夜培养。
3. 4000 rpm离心15分钟。
4. 用20 ml溶液I（50 mM D-葡萄糖，25 mM Tris-HCl，10 mM EDTA）重悬沉淀，转移至250 ml离心管中。
5. 冰上孵育5分钟。
6. 此后仅使用塑料移液管！加入50 ml新鲜配制的溶液II（0.2 N NaOH，1% SDS），轻轻混匀。
7. 冰上孵育5分钟（切勿超过！）。
8. 加入37.5 ml溶液III（8 M乙酸铵），轻轻混匀直至出现白色絮状物。
9. 冰上孵育10分钟。
10. 使用GSA转子，10000 rpm离心30分钟。
11. 用四层纱布过滤上清液至新离心管中。
12. 加入0.6倍体积的异丙醇（70 ml），混匀，室温孵育20分钟（延长至1小时效果更佳）。
13. 使用GSA转子，10000 rpm离心20分钟。
14. 保留沉淀，擦干管口（管壁上也有不易看见的沉淀）。用4 ml去离子水重悬沉淀，转移至聚丙烯管中，确保沉淀充分重悬。
15. 加入8 M乙酸铵，轻轻混匀1分钟。
16. 冰上孵育10分钟。
17. 使用HB-4转子，8000 rpm离心10分钟。
18. 转移上清液至新管中。
19. 加入6 ml异丙醇，轻轻混匀（可在此步于-20°C过夜，或室温孵育15分钟）。
20. 8000 rpm离心10分钟。
21. 保留沉淀。
22. 用70%乙醇洗涤：加满管，离心至5000 rpm，弃去上清。
23. 用1 ml去离子水重悬沉淀。
24. 加入20 μl RNA酶A（5 mg/ml），37°C孵育30分钟。
25. 加入580 μl去离子水。
26. 加入400 μl 4 M NaCl，轻轻混匀。
27. 加入2 ml 13% PEG 8000，轻轻混匀。
28. 冰上孵育1小时。
29. 80000 rpm离心20分钟。
30. 保留沉淀，用70%乙醇如前洗涤。
31. 干燥试管，用3.3 ml去离子水充分重悬。
32. 加入1.7 ml 8 M乙酸铵，轻轻混匀。
33. 酚/氯仿/异戊醇抽提，台式离心机离心5分钟。
34. 如不干净，重复步骤33。
35. 氯仿/异戊醇抽提两次。
36. 加入2.5倍体积的100%乙醇。
37. 10000 rpm离心30分钟。
38. 用70%乙醇如前洗涤。
39. 干燥，用200 μl去离子水重悬DNA。 配方 （原文未提供具体配方，此处保留空白） 耗材 （原文未提供具体耗材，此处保留空白） 提示 （原文未提供具体提示，此处保留空白） (责任编辑：泉水) |