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描述

按照本方案，可以分离大单拷贝质粒（包括Ti质粒），以及任何高拷贝和/或较小质粒。由于在大多数情况下，双元质粒的拷贝数高于Ti质粒，因此双元质粒的限制性酶切图谱将比Ti质粒更亮。对于单拷贝双元质粒，可能需要通过Southern印迹来区分双元质粒与Ti质粒的图谱。

无论如何，您都会看到来自Ti质粒消化的条带。因此，必须同时制备不含双元质粒的农杆菌菌株作为对照。根据经验，NotI酶切可以很好地显示pTi的图谱。目前尚未找到一种能一致分离小质粒而不分离大质粒的方法，因此本方案适用于所有情况。

该方案对C58菌株效果很好，但对Ach5菌株的回收率较低。

步骤

1. 在30°C下，将5 ml过夜培养物（LB+抗生素）培养36-48小时。
2. 在4°C下，以约1500g（Beckman JA-10转子，3500 rpm）离心15分钟。
3. 倒掉上清液，将沉淀置于冰上，直到所有样品准备重悬。
4. 用200 μl溶液I（50 mM葡萄糖，10 mM EDTA，25 mM Tris-Cl pH 8.0，新鲜加入5 mg/ml溶菌酶）涡旋重悬沉淀。所有样品重悬后，转移至1.5 ml微量离心管中，室温孵育10分钟。
5. 加入400 μl新鲜配制的溶液II（1% SDS，0.2 N NaOH），颠倒混匀4次，室温孵育10分钟。将另一微量离心管架倒扣在管子上方，同时颠倒所有管子。
6. 加入60 μl新鲜配制的碱性酚（2体积0.2 N NaOH + 1体积Tris饱和酚，使用前新鲜混合，通常为单相），如上颠倒混匀16次。
7. 立即加入300 μl 3 M NaAc（pH 5.0），颠倒混匀20次。
8. 在-20°C孵育20分钟。
9. 使用具有慢加速和慢减速选项的微量离心机（如IEC MicroMax的“turtle”设置），室温离心5分钟。
10. 收集上清液至2.2 ml微量离心管中。如果颠倒操作正确，可回收约800 μl。有时仍有大量絮状物，只能回收约600 μl。从每个管中取出相同体积。
11. 加入等体积Tris平衡酚，颠倒混匀20次进行抽提。
12. 室温下以“turtle”模式离心5分钟。
13. 将上层水相转移至新的2.2 ml微量离心管中，加入2倍体积冰浴的95%乙醇（-20°C）。
14. 颠倒混匀4次，室温下以“turtle”模式离心10分钟。
15. 用500 μl冰浴的70%乙醇（-20°C）洗涤沉淀，以“turtle”模式离心2分钟。
16. 在真空干燥器中干燥约10分钟。
17. 用40 μl TE轻轻重悬沉淀。
18. 取15 μl用于标准凝胶电泳，20 μl用于脉冲场凝胶电泳。
19. 凝胶条件：0.7%琼脂糖，1× TAE缓冲液，30-40 V过夜，或脉冲场凝胶。

配方

LB培养基：Lennox L Broth Base（GIBCO BRL），高压灭菌。每升去离子水：蛋白胨140（胰酶消化酪蛋白）10 g，酵母提取物（自溶，低钠）5 g，氯化钠5 g。琼脂平板另加：细菌琼脂（2%）20 g。用于大肠杆菌（37°C培养）和农杆菌（30°C培养）。

SOC培养基：用于电转化后细胞复苏，高压灭菌。每升去离子水：细菌蛋白胨20 g，酵母提取物5 g，NaCl 0.6 g，KCl 1.86 g，MgCl2 2.04 g，MgSO4 2.46 g，葡萄糖3.6 g。电转化后，将细胞从电转杯转移至含有SOC培养基的无菌管中，室温下孵育：大肠杆菌37°C约40分钟，农杆菌30°C约60分钟。

高蔗糖琼脂培养基：用于BIBAC载体中插入片段的阳性选择（sacB基因失活）。向1升Lennox L Broth琼脂中加入100 ml 50%蔗糖（高压灭菌或过滤灭菌均可）。加入所需抗生素，注意终体积为1100 ml。

3-酮苷试验：基于农杆菌属与其他细菌（如埃希氏菌属和根瘤菌属）的代谢差异（Bernaerts and DeLey, 1963, Nature 197, 406-7）。农杆菌在乳糖上生长时会产生一种酶，称为己糖吡喃糖苷细胞色素C氧化还原酶，可将乳糖转化为3-酮乳糖。

3-酮培养基：每升去离子水：乳糖10 g（1%），酵母提取物1 g（0.1%），细菌琼脂20 g（2%）。将菌株划线接种于平板上，30°C培养。出现菌落后，用薄层Benedict试剂覆盖平板，室温放置。在农杆菌产生3-酮乳糖的地方会出现黄色CuO环。注意：不同农杆菌菌株产生的黄色强度差异很大。

Benedict试剂：柠檬酸钠86.5 g，无水碳酸钠50 g，加蒸馏水至425 ml。快速搅拌下，加入8.7 g五水硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶于50 ml蒸馏水中。

文库冷冻混合液（Texas A&M BAC Center）：菌落保存在含有10%冷冻混合液和相应抗生素的LB中。10×冷冻混合液：360 mM K2HPO4，132 mM KH2PO4，17 mM柠檬酸钠，4 mM MgSO4，68 mM (NH4)2SO4，44%甘油。高压灭菌后室温保存。储存后可能出现沉淀，使用前充分混匀。冷冻混合液-LB-抗生素混合物应每几天新鲜配制。使用多通道移液器每孔加入50 μl LB+冷冻混合液+抗生素。

耗材

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提示

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