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描述

本文详细描述了番茄（Solanum lycopersicum）的遗传转化实验方案，包括种子灭菌、萌发、农杆菌介导的转化、共培养、愈伤组织诱导、芽再生、生根及转基因植株的驯化与筛选。该方案适用于多种番茄品种，如VF36、Mottle和Money-Maker，是植物基因工程研究中的经典方法。

实验步骤

1. 种子灭菌与萌发

将干燥的番茄种子在70%乙醇中灭菌2分钟，随后在3.3%次氯酸钠（10%次氯酸钠的1:3稀释液）中加入0.1% Tween 20，于250 ml锥形瓶中用磁力搅拌器快速搅拌20分钟。之后用无菌双蒸水冲洗3次。将灭菌后的种子播种于Nitsch培养基（含0.8%琼脂）的Magenta盒中，密度因品种而异（VF36和Mottle每盒100粒，Money-Maker每盒25粒）。在25°C、光照条件下萌发。

2. 外植体制备

当子叶展开且真叶尚未出现或极小时，取幼苗。将幼苗顶部成批剪下，立即浸入Jones液体培养基中。在培养皿（100×15 mm）中切割子叶外植体：握住幼苗茎部使其倒置，将子叶在近轴端（宽端）和远轴端（保留约2/3子叶）切割，切割时子叶浸没于培养基中。将切好的子叶倒置（近轴端朝下）置于饲养层平板上（100×15 mm），饲养层平板含有MS培养基（含1 mg/L 2,4-D和100 μM乙酰丁香酮），其上铺有一层悬浮细胞（胡萝卜或烟草细胞，对数生长期）和无菌滤纸。子叶密集放置（每张直径7 cm的Whatman #1滤纸上放置60-100片子叶）。

3. 农杆菌培养与侵染

将子叶在生长室（25°C，黑暗）中预培养24小时，同时培养农杆菌：在50 ml试管中加入10 ml 2YT培养基（含适当抗生素），于28°C、230 rpm、黑暗条件下振荡培养过夜。将农杆菌菌液用Jones培养基（含100-200 μM乙酰丁香酮，pH 5.2）稀释至OD600=0.25-0.35。取7-10 ml稀释菌液分装至50×15 mm培养皿中。将一平板上的子叶浸入含10 ml农杆菌悬液的培养皿中，室温孵育15-30分钟。取出子叶，用无菌Whatman #1滤纸吸去多余菌液，然后放回饲养层平板（密度降低至每板30-50片子叶）。

4. 共培养与筛选

共培养40-48小时后，将子叶转移至含SL.1培养基（0.8%琼脂）的100×15 mm培养皿中，子叶倒置放置。用保鲜膜封口，放回生长室培养。通常在10-15天内，子叶近轴端会出现愈伤组织、绿色突起或芽。14天后，将子叶转移至含SL.2培养基（0.8%琼脂）的100×20 mm培养皿中，促进芽器官发生。2周后，将芽或愈伤组织从衰老的子叶上切下，再次转移至SL.2培养基平板，继续培养2周。随后将芽转移至SL.3培养基平板（3-4周）。

5. 生根与移栽

将正常生长的芽转移至生根培养基（Nitsch培养基含150 mg/L羧苄青霉素、50 mg/L卡那霉素和1-2 mg/L IBA）。芽在7-15天内生根。将生根的植株移栽至湿润土壤中，置于弱光条件下，使用小盆并覆盖透明容器以保持湿度。移栽前应冲洗掉根部残留的琼脂。在5天内逐渐打开容器盖。植株驯化后，可移栽至大盆并置于温室中。

6. 转基因种子筛选

收获R1代种子，在含50 mg/L卡那霉素的Nitsch培养基上萌发，筛选卡那霉素抗性植株。抗性植株表现为：植株较高、根系分支、下胚轴花青素色素减少或无。敏感植株虽能萌发但矮小、根系短且无分支、下胚轴花青素色素增强。筛选在播种后2-4周进行最为可靠。

培养基配方

Jones培养基：MS无机盐 + Nitsch维生素。
2YT培养基：细菌蛋白胨16 g/L，酵母提取物10 g/L，NaCl 5 g/L。
Nitsch培养基：MS无机盐，肌醇100 mg/L，盐酸硫胺素0.5 mg/L，甘氨酸2 mg/L，烟酸5 mg/L，叶酸0.5 mg/L，生物素0.05 mg/L，蔗糖20 g/L，琼脂0.8%，pH 5.8。
SL.1培养基：Jones培养基 + 400 mg/L羧苄青霉素（或400 mg/L头孢噻肟）+ 1 mg/L玉米素 + 100 mg/L卡那霉素（再生培养基）。
SL.2培养基：Jones培养基 + 250 mg/L羧苄青霉素（或300 mg/L头孢噻肟）+ 100 mg/L卡那霉素 + 1 mg/L玉米素 + 0.5 mg/L玉米素核苷。
SL.3培养基：Jones培养基 + 250 mg/L羧苄青霉素（或300 mg/L头孢噻肟）+ 100 mg/L卡那霉素 + 0.1-0.2 mg/L玉米素（再生芽伸长培养基）。
生根培养基：Nitsch培养基 + 150 mg/L羧苄青霉素（或200 mg/L头孢噻肟）+ 50 mg/L卡那霉素 + 1 mg/L IBA。

注意事项

1. 所有操作需在无菌条件下进行。
2. 农杆菌侵染时间不宜过长，以免对子叶造成伤害。
3. 卡那霉素筛选浓度需根据品种优化。
4. 移栽时注意保湿，逐步降低湿度以适应环境。