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描述

NGFR（神经生长因子受体）基因的HindIII多态性是一种限制性片段长度多态性（RFLP），可用于遗传关联研究。该多态性位于NGFR基因内含子区域，通过HindIII限制性内切酶消化PCR扩增产物进行基因分型。

实验步骤

PCR扩增

模板：基因组DNA 100-200 ng，反应总体积25 μl。

引物：

• 正向引物 NGFRHND3F：5' CCC CTT GCGG ATG TTC TC 3'，用量90 ng/反应
• 反向引物 NGFRHND3R：5' GTG GGA TGG CTG GAC CTG 3'，用量90 ng/反应

dNTPs：终浓度各200 μM。

缓冲液：终浓度1.5 mM MgCl2，50 mM KCl，10 mM Tris-HCl pH 8.4。

Taq DNA聚合酶：0.5 U/反应（Perkin-Elmer Amplitaq DNA聚合酶，5 U/μl，货号N808-0145）。

PCR循环条件：94°C预变性5分钟；94°C 30秒，58°C 30秒，72°C 30秒，共30个循环；72°C延伸7分钟。

HindIII酶切

PCR产物（492 bp）经HindIII酶切后，若存在多态性位点，则产生324 bp和168 bp两个片段；若不存在，则保持492 bp。通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。

试剂与耗材

标准分子生物学试剂，包括dNTPs、Taq聚合酶、HindIII内切酶及相应缓冲液。PCR产物纯化试剂盒可选。

注意事项

确保基因组DNA质量良好，避免RNA污染。PCR循环中退火温度可根据引物Tm值优化。酶切反应需充分进行，建议37°C孵育1小时以上。