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描述

氯化钙法制备感受态细胞是分子生物学中一项经典且广泛使用的技术。该方法通过将处于对数生长期的细菌细胞用氯化钙溶液处理，改变细胞膜的通透性，使其能够高效摄取外源质粒DNA。随后通过热激处理，促进质粒DNA进入细胞，实现转化。本方案详细描述了从感受态细胞制备到转化的完整步骤，适用于大肠杆菌等常用菌株。

实验步骤

感受态细胞制备

1. 从新鲜平板上挑取单个菌落，接种于5 mL LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜（约12-16小时）。

2. 取1%过夜培养物（约1 mL）接种至100 mL LB培养基中，37°C振荡培养至OD600达到0.6（约需3小时）。

3. 将培养物转移至预冷的50 mL离心管中，冰浴10分钟。

4. 4°C下4000 rpm离心10分钟，弃上清。

5. 用10 mL预冷的0.1 M CaCl2重悬菌体，冰浴30分钟。

6. 4°C下4000 rpm离心10分钟，彻底弃去上清。

7. 用2 mL预冷的0.1 M CaCl2（含15%甘油）重悬菌体。

8. 分装为200 μL每管，液氮速冻后保存于-70°C。

9. 用标准质粒（如pUC19）转化以检测效率。

转化步骤

1. 将质粒DNA加入200 μL感受态细胞中，冰浴30分钟。

2. 42°C热激45秒。

3. 冰浴2分钟。

4. 加入800 μL LB培养基，37°C振荡培养1小时。

5. 取100 μL涂布于含氨苄青霉素的LB平板（若质粒携带Amp抗性基因）。

6. 37°C培养16-20小时。

7. 平板上可见携带质粒的大肠杆菌菌落。

所需试剂与材料

所需大肠杆菌菌株的划线平板；0.1 M CaCl2；含15%甘油的0.1 M CaCl2；无菌离心管；LB培养基；LB-氨苄青霉素平板。

注意事项

离心速度不宜过高，否则菌体沉淀过紧，难以重悬。菌液达到所需OD后，务必始终置于冰上。