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选择是育种中最重要环节之一，传统育种方法通过表现型间接对基因型进行选择，存在周期长、效率低等缺点。最有效的选择方法是直接依据个体基因型进行选择，分子标记的出现为这种直接选择提供了可能。借助分子标记达到对目标性状基因型选择的方法称为分子标记辅助选择（molecular-assisted selection，MAS），包括对目标基因跟踪即前景选择（foreground selection）或正向选择，和对遗传背景选择（background selection），也称负向选择。背景选择可加快遗传背景恢复速度，缩短育种年限和减轻连锁累赘的作用。

1 分子标记辅助选择（MAS）的主要进展

近年来基因组研究的迅速发展为许多农作物提供了大量分子标记技术和多种多样的检测手段，使得MAS应用于作物遗传改良已成为现实，并取得了长足进展，主要集中体现在以下几个方面。

1.1 基因聚合（gene pyramiding）

作物的有些农艺性状（抗病等）表达呈基因累加作用，即集中到某一品种中同效基因越多则性状表达越充分。基因聚合（gene pyramiding）就是将分散在不同品种中的优良性状基因通过杂交、回交、复合杂交等手段聚合到同一个品种中。在这一过程中，一般只考虑目标基因（前景）选择而不进行背景选择。最成功的例子是抗病基因聚合。在水稻抗白叶枯病上，Huang等（1997）运用MAS技术分别将2～4个白叶枯病抗性基因Xa4、xa5、xa13和Xa21聚合到同一水稻（Oryza sativa）品种中。在水稻抗稻瘟病上，Hittalmani等（2000）选用3个含单抗性基因的近等基因系分别两两杂交，从F2代选到含有两个抗性基因的植株，然后将各含两个抗病基因的单株继续聚合杂交，从F2代选到了同时含有Pil/Piz-5/Pita的改良单株。在小麦抗性基因聚合上，王心宇等（2001）利用与白粉病抗性基因Pm2、Pm4a、Pm8和Pm21紧密连锁的RFLP（restriction fragment length polymorphism）和SCAR（sequence characterized amplified region）标记进行MAS，选到分别聚合两个抗性基因的植株。此外，柳李旺等（2003）将棉花（Gossypium hirsutum）胞质雄性不育恢复系0-613-2R与转Bt基因抗虫棉R019（轮回亲本）杂交、回交产生BC2群体。利用CMS恢复基因Rf1紧密连锁的3个SSR（single sequence repeats）标记和Bt基因特异的STS（sequence tagged site）标记进行MAS，培育出聚合有Rf1和Bt基因抗虫棉恢复系。

1.2 基因转移（gene transfer）

基因转移（gene transfer）或称基因渗入（gene transgression）是指将供体亲本中有用基因（即目标基因）转移或渗入到受体亲本遗传背景中，从而达到改良受体亲本个别性状的目的。育种过程中将分子标记技术与回交育种相结合，可以快速地将与分子标记连锁的基因转移到另一个品种中，在这一过程中可同时进行前景和背景选择。Chen等（2000）以IRBB21为供体材料，对生产上广泛使用的‘明恢63’进行MAS改良，找到4个与Xa21紧密连锁的PCR标记。其中RGl03、248与Xa21共分离，C189、AB9分别在Xa21两侧0.8 cM和3.0 cM处，并且选用了标记间最大图距不超过30 cM均匀分布于每条染色体的128个RFLP标记用于背景选择。通过两代正向选择和负向选择，将导入片段限定在3.8 cM以内。在BC3F1代的250个抗性单株中，运用RFLP标记选择到2株除目标区域外遗传背景完全恢复为‘明恢63’的个体，自交一代后运用标记248选出基因型纯合的抗病单株，从而得到改良的‘明恢63’。彭应财等（2003）和童海军等（2003）选育出抗病（Xa21）审定组合协优218和Ⅱ优8220。王春明等（2003）利用抗叶蝉基因Grh2的CAPS（cleaved amplified plfmorphism sequence）标记，选出聚合抗叶蝉基因的水稻重要中间材料。Liu等（2003）应用MAS技术将抗稻瘟病基因Pil回交转到‘珍汕97’中，得到背景恢复达97.01％的抗病材料。王新望等（2000）利用3个SCAR标记对5Bphlb单体进行MAS，仅3个世代就获得了3个冬小麦（Triticum aestivum）phlb中间育种系，大大缩短小麦育种年限，加快了育种进程。夏军红等（2002）通过MAS与传统选育相结合的手段，将玉米（Zay mays）S组CMS恢复主效基因Rf3进行有效转移，选出新型的恢复系MO17（Rf3）和HZ85（Rf3）。

1.3 数量性状的MAS

作物大多数农艺性状（如产量、品质、抗逆性等）表现为数量性状遗传特点，表现型与基因型之间往往缺乏明显对应关系，表达不仅受生物体内部遗传背景较大影响，还受外界环境条件和发育阶段影响。对这些性状运用MAS，育种者可以在不同发育阶段，不同环境直接根据个体基因型进行选择，既可以选择到单个主效QTL（quantitative trait loci），也可以选择到所有与性状有关的微效位点，从而避开了环境因素和基因间互作带来的影响。虽然数量性状的操作较质量性状困难得多，但近年来也取得了许多可喜成果。Stuber（1995）通过MAS技术，在回交过程中同时进行前景选择和背景选择，把定位与产量有关的玉米QTLs分别从Tx303和Oh43转移到B73和Mo17两个自交系中，结果表明由这两个新改良自交系组配的杂交种，产量比对照杂交种增产15％以上。沈新莲等（2001）用2个RAPD（random amplified polymorphism DNA）标记和1个SSR标记对一高强纤维主效QTL进行MAS，提高了棉花纤维强度。研究者们利用SSR标记将产量相关的QTL从野生稻转入栽培稻（Brondani et al.，2002；邓启云等，2004）。此外在作物的品质、抗性等数量性状的改良上均有较好的应用（Walker et al.，2002；Zhou et al.，2003；Dholakia et al.，2003；Zhou et al.，2003）。

2 影响分子标记辅助选择（MAS）的因素

大量理论和实践研究表明，影响MAS选择效率的因素非常复杂，其中标记与基因（QTL）之间的距离、目标性状的遗传率、群体大小和性质、选用分子标记数目以及标记与基因（QTL）的连锁相等是重要因子。

2.1 标记与连锁基因（QTL）间的连锁程度

前景选择的准确性主要取决于标记与目标基因的连锁强度，标记与基因连锁得愈紧密，依据标记进行选择的可靠性就愈高。若只用一个标记对目标基因进行选择，则标记与目标基因连锁必须非常紧密，才能达到较高正确率。在理论上，在F2代通过标记基因型MM选择目标基因型QQ的正确概率P和标记与基因间重组率r有如下关系：P=(1-r)2，若要求选择P达到95％以上，则r不能超过2.5％，当r超过10％时，则P降至81％以下。如果用两侧相邻标记对目标基因进行跟踪选择，可大大提高选择正确率。在单交换间无干扰的情况下，在F2代通过标记基因型M1M1和M2M2选择目标基因型QQ的P值和r有如下关系：P=(1-r1)2(1-r2)2/[(1-r1)(1-r2)+r1r2]2，即使r1、r2均达20％时，同时使用两个标记P值仍然有88.5％。潘海军等（2003）在水稻MAS（Xa23）中，用单标记RpdH5和RpdS1184的准确率分别为91.10％和87.13％，同时使用这两个标记MAS准确率则达99.0％，可见双标记选择效率比单标记高。此外，重组值r也影响到由该标记位点等位基因分离产生遗传方差的大小，r值越小，遗传方差越大，数量性状的选择效率越高（Dudley，1993）。

2.2 性状的遗传率

性状的遗传率极大地影响MAS选择效率。遗传率较高的性状，根据表型就可较有把握地对其实施选择，此时分子标记提供信息量较少，MAS效率随性状遗传率增加而显著降低。在群体大小有限的情况下，低遗传率的性状MAS相对效率较高，但存在一个最适大小，在此限之下MAS效率会降低，如在0.1～0.2时，MAS效率会更高，但出现负面试验频率也高一些（QTL检测能力下降等）。因此利用MAS技术所选性状的遗传率应在中度（0.3～0.4）会更好（Moreau et al.，1998；Berloo et al.，1999）。

2.3 群体大小和性质

群体大小是制约MAS选择效率的重要因素之一。一般情况下，MAS群体大小不应小于200个。选择效率随着群体增加而加大，特别是在低世代，遗传率较低的情况下尤为明显（Hospital et al.，1997a；Moreau et al.，1998）。所需群体数的大小随QTL数目的增加呈指数上升。计算机模拟表明：遗传率为0.1时，转移5个QTL较2个所需群体将增加8倍（Zhou et al.，2003）。群体连锁不平衡性越大，MAS效率就越高。由两个自交系杂交产生的F2群体，其连锁不平衡性往往最大，因而其MAS效率也较高。

2.4 选用分子标记数目和类型

理论上标记数越多，从中筛选出对目标性状有显著效应的标记机会就越大，因而应有利于MAS，事实上，MAS效率随标记数增加先增后减。MAS效率主要取决于对目标性状有显著效应的标记，因而选择时所用标记数并非越多越好。Gimelfarb和Lande（1994）的研究表明，利用6个标记时，MAS效率明显高于3个标记，但用12个甚至更多时，MAS效率在低世代时反而降低，在高世代时增幅很小。一条染色体上有多个标记时，存在一个最适标记密度，在此之上则相对效率降低。计算机模拟研究表明当每条染色体上标记数增加到6个以上时效率降低（Moreau et al.，1998），最优距离为20 cM（Hospital et al.，1997a）。沈新莲等（2001）用2个RAPD标记和1个SSR标记进行纤维强度QTL辅助选择，比较显性标记和共显性标记之间纯合基因型和杂合基因型之间选择差异后，认为共显性SSR标记（可有效地剔除杂合基因型）对以加性/隐性为主遗传的QTL进行MAS效果会更好。

2.5 显性标记的相位

对质量性状的选择，无论目标基因是否显隐性，均需选择到纯合植株，但显性标记无法鉴定纯合与否。Haley等（1994）研究菜豆（Phaseolus vulgaris）普通花叶病毒（BCMV）隐性抗性基因（bc-3）两RAPD标记一个相引（M1，1.9 cM），另一个相斥连锁（M2，7.1 cM）时，用M1选择到纯合抗病、杂合体、纯合感病比例分别是26.3％、72.5％、1.2％，而用M2分别是81.8％、18.2％、0，据此提出相斥相显性RAPD标记不论对显性还是隐性基因均可极大提高选择效率。由此可预见用相斥相的显性SCAR标记跟踪目标基因比相引相应更有效。

2.6 世代的影响

在早代（BC1）变异方差大，重组个体多，中选机率大，因此背景选择时间应在育种早期世代进行，随着世代的增加，背景选择效率会逐渐下降（Chen et al.，2000）。在早期世代，分子标记与QTL的连锁非平衡性较大，随着世代的增加，效应较大的QTL被固定下来，MAS效率随之降低（Hospital et al.，1997a；Luo，1998）。

2.7 控制性状基因（QTL）数目

模拟研究发现随着QTL增加，MAS效率降低。当目标性状由少数几个基因（1～3）控制时，用标记选择对发掘遗传潜力非常有效，然而当目标性状由多个基因控制时，由于需要选择世代较多，加剧了标记与QTL位点重组，降低了标记选择效果，在少数QTL可解释大部分变异的情况下，MAS效率更高（吴为人等，2002）。

2.8 控制数量性状QTL的划分、定位及其效应分布

QTL的准确发现和对其效应无偏估计（unbiased estimates of QTL effects）有助于MAS效率提高（Willcox et al.，2002）。QTL精确定位取决于分子连锁图谱的饱和度以及对QTL性状的准确度量，可利用永久分离群体通过反复试验精确定位QTL。Bohn等（2001）提出用CV（cross validation）和IV（validation with an independent sample）分析方法对QTL效应和标记QTL遗传方差进行无偏估计。互作大小直接影响着MAS效率。在特定条件获得的QTL分子标记连锁关系在不同年份间表现会不一致，在不同环境下进行表型鉴定也可能会造成QTL不一致。一般在不同年份间不同时期不同地点均能检测到的QTL的效果较好。基因型对QTL检测有较大影响，杂交早代植株基因型是杂合的，随着自交代数增加，许多位点趋于纯合，在早代选择的植株到高代表现会与原先表现不一致，应重新估价和筛选分子标记（Hospital et al.，1997a）。同一性状在不同群体间甚至不同群体大小间的QTL不一致，这些因素均影响QTLs检测并影响MAS的效率（Moreau et al.，1998）。实践中，沈新莲等（2001）在棉花纤维强度MAS改良过程中，QTL在不同遗传背景、不同分离世代中稳定遗传，效应稳定，取得了理想结果。低遗传率（0.3）时，QTLs效应分布呈几何分布较呈均等效率高，但在高遗传率时二者间差异不大（Berloo et al.，1998；吴为人等，2002）。

2.9 选择强度和QTLs的遗传方式和相位

在高选择强度下，常规选择更易丢失有利基因，MAS效率随着选择强度升高而增加（Berloo et al.，1998）。显性作用随着世代增加而降低，因此显性遗传QTLs的MAS效率高。当对多个QTL进行选择时，相引连锁比相斥连锁MAS效率高（吴为人等，2002）。此外，Chen等（2000）发现用标记进行消除连锁累赘时，两代单交换选择效率比一代双交换高，成本小。在低遗传率（＜0.3），一类错误（假阳性）提高对MAS效率反而有利（Hospital et al.，1997a）。在中等或较低选择强度下，目标基因（QTL）周围染色体区段由较远端标记控制更有效（Hospital et al.，1992）。

3 分子标记辅助选择（MAS）的发展策略

在表型选择有效的情况下，MAS更适用于隐性、限性、测定困难或费用昂贵以及未成熟期鉴定性状。在实际运用过程中应用一定策略，降低应用成本，MAS的作用将可得到更大发挥。

3.1 定位作图与育种同步进行

育种群体与定位群体之间的重组频率是有变化的，不一定相同，在不同群体中QTL检测一致性低，而在同一群体不同世代中较高（Bohn et al.，2001）。研究者对目标基因进行定位是为了利用这些基因，一个重要途径就是进行MAS提高育种效率，为大规模培育优良品系或品种创造条件，而MAS希望使用在育种群体中与目的基因重组率仍旧较低的标记。方宣钧等（2001）建议选择杂交亲本时尽量使用与育种直接有关的材料，所构建群体应尽可能做到既是遗传研究群体，又是育种群体，这样定位与MAS同步进行可缩短基因（QTL）定位研究与育种应用的距离，提高育种效率和MAS效益。

3.2 选择合适标记类型

适合于MAS的分子标记必须符合如下几个条件：检测手段简单快捷，易于实现自动化；DNA质量要求不高，用量少，可以同时分析大量样品；信息量大，分析效率高；多态性好，在基因组中大量存在而且分布均匀；开发成本和使用成本低。目前已经发展出十几种标记技术，比较常用有RFLP、RAPD、SSR、AFLP（amplified fragment length polymorphism）、SCAR、STS和CAPS等。理想分子标记应该是建立在PCR技术基础上，重复性高，在广泛基因背景下都能表达，在不同研究者中能相互交换使用，并能有效跟踪目标基因的标记，如水稻抗白叶枯病基因Xa21标记pTA248。而选用何种分子标记来进行MAS选择，直接关系到选择效果。对于前景（目标基因）选择，所有标记技术都可以采用，但PCR标记最佳，共显性SSR、CAPS和STS是首选标记，其次是SCAR。至于背景选择，应根据情况灵活选用，目前在低世代最合适的是RAPD、AFLP和SSR等，但在高世代AFLP由于可检测到更多多态位点而优于其他标记。夏军红等（2000）比较AFLP和SSR两种标记背景选择的相关性，发现达显著水平，结果具有同一性。因此，在实际应用过程中，选用一种标记类型进行背景选择即可。

3.3 DNA提取的简化

1）半粒种子提取供试DNA。将谷物类种子切分成两部分，带胚一半用于发芽播种，另一半胚乳用含蛋白酶K提取反应液，50℃～55℃温浴1小时，快速离心，100℃处理5分钟，离心后的上清液含有DNA，可用作PCR分析。每次提取的DNA可进行25～50次STS反应和250～1000次RAPD反应。与叶片DNA结果一致，这种方法可进行早代选择（Chunwongse et al.，1993；翟文学等，1996）。2）碱法抽提DNA。王春明等（2003）从播种1～2周后水稻幼苗上取1～3 cm长叶片放入备有适量0.4 mol·L-1 NaOH的离心管中，用塑料棒碾磨至液体呈绿色，加160 μL Tris（100 mmol·L-1，PH7.5）充分混匀，以稀释60倍后的上清液（浓度约5 ng·mL-1）作为模板DNA（可置20℃保存），取2 mL至PCR板中进行CAPS分析（反应体系为20 mL）。原有的DNA大量提取法1个人平均1天能提取6～8个样品，而这些简便、快速DNA提取方法材料用量小，程序简单，化学试剂数量及用量少，DNA质量高、数量多，每天均可以提取200个样品，完全可满足MAS育种需要。更简单的方法是利用成熟花粉粒制成悬液（经旋涡振荡和高温物理作用）后，可作为一种快速、简便、廉价的基因组DNA模板液直接用于PCR扩增（朱苏文等，2002）。

3.4 快速PCR检测手段和体系优化

建立快速的PCR检测技术，检测显性SCAR标记时，可将琼脂糖凝胶电泳检测步骤省去，直接在PCR反应管中加入EB染色，在紫外灯下观测扩增产物的有无或者测定PCR产物浓度，鉴定是否有大量DNA存在，从而确定样品中是否含有目标基因（王新望等，2000）。改造染色系统，利用甲烯蓝染琼脂糖凝胶，可直接在可见光下检测产物的有无。减少PCR反应体积，可从20 μL减少到15甚至10 mL，可大大地降低费用。当同时筛选到2个或以上的分子标记与目标性状连锁时，扩增产物具有不同长度但引物复性温度相匹配则可以在同一PCR条件下同时反应，这种多重PCR法的应用可显著地降低选择成本和筛选时间（王孝宣等，2003）。

3.5 背景选择逐步选择法

段红梅等（2003）对大豆MAS效果分析表明，用20条SSR引物与全部51条引物选出各株系的遗传背景回复率数值不同，排序也有差别，但是选择到相同株系比例较高。同时比较不同引物数目（10，20，30，40）与全部51条引物遗传背景回复率的相关性，相关系数分别为0.7520、0.8651、0.9344和0.9726，随着引物增加，相关程度也在增加，用40条引物几乎可得到51条的相同选择效果。夏军红等（2000）对玉米染色体遗传背景回复率与基因组回复率的偏相关分析研究表明，绝大多数染色体与基因组遗传背景回复率的偏相关达显著水平，据此认为对有限数目染色体（一条或多条）进行背景选择可以达到对整个基因组选择类似结果。因此在背景选择中，当初始群体较大时，可以根据少数引物淘汰部分不符合选择要求的材料，再对遗传背景回复率较高的剩余材料增加标记进行进一步精确分析，在下一个世代对已恢复为轮回亲本的位点可不再选择。采用这种逐步选择方式，最终仍可选到最佳株系，这样可大大减少工作量，提高选择效率。

3.6 确定适宜的标记数量

使用3个分子标记的MAS（Xa23）符合率并不比使用2个有显著提高（潘海军等，2003），在实际应用中，选择2个位于基因两侧最近分子标记，这样不仅可以提高准确率，而且可以增加中选个体与受体亲本遗传背景同质性。Hospital等（1997a）认为对每一个QTL最好用3个相邻的连锁标记进行跟踪选择，其中一个靠近目标QTL，另两个近乎对称处在两侧。每条染色体（200 cM）或每一连锁群上2～4个标记用于背景选择，可得到理想选择结果（段红梅等，2003）。选用标记时，首先应筛选出效应显著标记，当标记达到限度后，用低密度标记可降低成本减轻工作量，而不影响效率（Moreau et al.，1998）。

3.7 数量性状标记辅助选择的方法

根据选择依据不同，数量性状标记辅助选择方法可分为基因型选择和基因型值选择两种。吴为人等（2002）用计算机模拟方法，对两种选择方法的潜力进行了比较，结果显示，两种方法的基本规律相似，除了在QTL数目很多又效应相等的情况下基因型选择表现较优之外，在其他情况下，两种方法的效果差不多。相对来说，基因型选择方法可以避免非加性效应和环境效应影响，因此具有优越性，但从应用角度看，基因型选择与基因型值选择相结合应是今后的发展方向。

3.8 确定合适选择方案

对于一些虽受主效基因控制，但可能还受一些背景基因影响的性状，只要供体亲本本身综合性状优良，就没有必要多次回交。可根据育种目标不同而进行1～2次回交或不回交，既可节约成本，提高育种成效，又可防止导入的基因丢失（罗彦长等，2003）。在群体不够大，QTL定位不够准确，每次至多导入4个QTL，并且分步骤聚集QTL的回交育种方案比同时导入若干QTL更有效（Hospital et al.，1997b）。用无重复的多点田间试验比一点重复试验易控制基因型与环境的互作并获得较大的遗传方差，并且可以检测出有利和不利QTLs，提高MAS的效率，降低成本（Ho et al.，2002）。Ribaut和Betran（1999）提出QTL辅助选择的SLS（single large scale）MAS方法，即要求QTLs最好不超过3个，而且这些QTLs在不同的遗传背景及环境表达下稳定，占的表型变异为最大。Ho等（2002）提出了AB-QTL（advanced backcross QTL）的选择方案，该方案可以打破QTLs间上位性作用，微效的加性和显性QTLs易检测出来，该方法将QTL的鉴定延迟了2～3代才进行，但可以大大缩短从QTL发现到品种培育的时间、从QTL的发现到测试QTL-NIL系仅需1～2年。Xie和Hu（1998）提出多性状同时MAS改良方法能聚集数量性状育种值，它的育种效果比常规方法选择或单个性状改良更好。因此我们可以根据育种的需要来确定合适的选择方案。

4 展望

尽管分子标记辅助选择（MAS）的背景选择效率很高，但在育种实践中，应将育种家的丰富选择经验和标记辅助选择相结合，依据个体表型进行背景选择的传统方法仍不应抛弃。而MAS普及的关键在于降低成本和简化操作流程。随着高通量测序技术和基因分型平台的发展，如SNP芯片和GBS（genotyping-by-sequencing），MAS正逐步向全基因组选择（genomic selection）过渡，后者利用全基因组标记估计育种值，尤其适用于复杂数量性状的改良。未来，MAS将与基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）结合，实现目标基因的精准导入和修饰，进一步加速作物育种进程。同时，整合多组学数据（转录组、代谢组等）和人工智能算法，有望提高QTL定位精度和选择效率，推动作物遗传改良进入智能化时代。