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【关键词】 地高辛配基

本研究旨在优化地高辛标记的原位杂交法，用于检测小鼠海马结构中神经肽Y的表达。通过比较不同固定条件、预处理方法和杂交缓冲液，建立了一种简便有效的实验方案。

摘要 目的：优化用地高辛标记的原位杂交法检测小鼠海马结构中神经肽Y的表达。方法：用体外转录法获得地高辛标记的神经肽Y反义和正义RNA探针。用海人藻酸诱导小鼠脑组织中神经肽Y表达，2小时后处死小鼠，制备12 μm厚的海马组织切片。比较不同pH值（7.5~9.5）的固定剂、不同固定时间、不同杂交前预处理以及不同预杂交及杂交液对杂交信号的影响。结果：pH 7.5~9.5的碱性固定液对杂交信号无明显影响；30分钟固定时间足以获得满意结果；用蛋白酶K部分消化或用Triton X-100打孔反而降低杂交信号；40 mg/L鲑鱼精DNA或250 mg/L酵母RNA可获得与Denhardt's溶液相同的杂交信号。结论：通过优化，获得了一种简便有效的地高辛标记原位杂交法，用于检测神经肽Y表达。

关键词 原位杂交；地高辛；神经肽Y；脑切片

引言 近年来，非同位素标记的原位杂交法已大大缩短显影时间并提高组织分辨率。地高辛标记的原位杂交法是最广泛使用的非同位素检测方法。由于缺乏成熟的用于检测脑组织内神经肽Y表达的非同位素分析方法，本研究比较了常用实验方法，以优化神经肽Y的原位杂交检测。

1 材料和方法

1.1 材料 实验动物为8~10周龄C57BL/6小鼠，共4只，体质量28~32 g。实验前3天单独饲养，昼夜节律12/12小时。实验程序经辛辛那提大学动物保护和使用委员会批准，并严格遵守NIH实验动物保护和使用准则。海人藻酸购于Sigma公司，溶于生理盐水后用NaOH中和，按20 mg/kg腹腔注射。

1.2 方法

1.2.1 地高辛标记的神经肽Y反义及正义RNA探针制备 含有561 bp神经肽Y基因的质粒载体PT7T3DPac来自辛辛那提大学微阵列中心。载体经EcoR I或Hind III切割获得线性质粒。EcoR I线性化模板含T3启动子，用于转录反义探针；Hind III线性化模板含T7启动子，用于转录正义探针（阴性对照）。20 μL转录体系：4 μL 5×转录缓冲液，1 μL线性DNA，2 μL NTP（Dig-UTP），2 μL 0.1 mol/L DTT，9 μL H2O，1 μL RNase抑制剂，1 μL RNA聚合酶（T3或T7），37℃水浴2小时，加2 U DNase，37℃孵育15分钟去除DNA模板，加2 μL 0.2 mol/L EDTA（pH 8.0）终止反应，加2.5 μL 4 mol/L LiCl和75 μL -20℃预冷100%乙醇，混匀后-20℃放置2小时，2~8℃离心（44 500 g，15分钟），弃上清，真空干燥，加100 μL DEPC水37℃溶解30分钟，-80℃贮存备用。

1.2.2 切片制备和杂交 KA注射后2小时，颈椎离断法处死小鼠，快速分离脑组织，包埋于干冰5分钟，-80℃存放至少48小时后，作12 μm厚冠状切片，收集于DEPC处理后的Superfrost plus玻片上，室温干燥30分钟，存于-80℃备用。用40 g/L多聚甲醛固定后，PBS（DEPC处理）漂洗2×15分钟，随即进行杂交。用酵母RNA预杂交液（DEPC处理5×SSC，500 mL/L甲酰胺，250 mg/L酵母RNA，50 g/L硫酸葡聚糖，0.2 g/L无RNase BSA），58℃孵育2小时，然后加含200~400 mg/L探针的杂交液500 μL，在湿化杂交盒内58℃过夜孵育。用2×SSC室温漂洗30分钟，65℃漂洗1小时，0.1×SSC 65℃漂洗1小时，在buffer 1（0.1 mol/L Tris pH 7.5，0.15 mol/L NaCl）中作用5分钟，用含100 mL/L灭活羊血清的buffer 1封闭60分钟，在含1:1000碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体的buffer 1中孵育2小时，用buffer 1漂洗3×5分钟。在buffer 3（0.1 mol/L Tris pH 9.5，0.1 mol/L NaCl，0.05 mol/L MgCl2）中平衡5分钟，在含0.33 g/L NBT、0.16 g/L BCIP的buffer 3中孵育显色，直到获得预期杂交信号，用TE中止反应，在950 mL/L乙醇中漂洗1小时去除非特异本底，水漂洗去除TE结晶，乙醇系列及甲苯脱水，封片后光学显微镜观察。

2 结果和讨论

2.1 固定时间对杂交信号的影响 多聚甲醛通过共价交联氨基基团固定组织，防止mRNA丢失。比较切片在40 g/L多聚甲醛PBS液中4℃固定10、30和60分钟的效果。固定10分钟的海马检测到较弱信号，而30分钟和60分钟均获得强信号，表明30分钟固定时间已足够。

2.2 碱性固定对杂交信号的影响 碱性固定可促进RNA和蛋白质变性，提高探针可接近性。比较pH 7.5、8.5、9.5的固定液，结果无明显差异。有研究认为酸性固定可增强信号，因此pH影响可能取决于组织类型和反应体系。

2.3 Triton X-100打孔及蛋白酶K消化对杂交信号的影响 切片固定后用1 mL/L Triton X-100或蛋白酶K消化30分钟，均导致组织形态保存受损且杂交信号下降，因此后续实验不再进行这些处理。

2.4 杂交缓冲液对杂交信号的影响 比较酵母RNA杂交液、鲑鱼精DNA杂交液和Denhardt's杂交液，三者获得相同杂交结果。反义探针检测到清晰信号，正义探针仅有微弱本底，证实方法有效性。

参考文献

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基金项目：国家留学基金资助项目（22861010）

通讯作者：李生斌。Tel: (029)82655474，Email: shbinlee@mail.xjtu.edu.cn

作者简介：武永飞（1970-），男，汉族，陕西省佳县人，博士生（导师李生斌）。Tel: (029)85394864，Email: wuyongfei@hotmail.com

（1西安交通大学卫生部法医学重点实验室，陕西 西安 710061；2 Department of Cell Biology, Neurobiology and Anatomy, University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, Ohio 45267, USA）

编辑：何扬举