引言
山中伸弥（Shinya Yamanaka）获得诺贝尔奖已有数年，尽管两年前在听完他的讲座后我曾兴致勃勃地写了两篇博客，但如今我仍愿花时间深入解析他的研究历程。本文旨在揭示科学发现的随机性与必然性，并向公众科普科研活动的真实面貌。
山中伸弥的成功是典型的小实验室自由探索的胜利。他的经历再次证明，许多科学突破是不可预测的。如果中国有大量优质的小实验室获得稳定资助，类似的科学突破将随机但必然地发生。因此，展示山中伸弥研究中的随机性与必然性，对于公众理解科研活动具有重要意义。
解析山中伸弥发现诱导多能干细胞（iPS）的来龙去脉，关键在于追踪他依次研究的基因：ApoBEC1、Nat1、Fbx15，最终发现iPS。有趣的是，他在研究这些基因时经历了两次方向转变：ApoB是血脂蛋白，研究其编辑酶ApoBEC1旨在调节血脂，却发现ApoBEC1过表达的小鼠患上肝癌；为探究致癌机制，他找到ApoBEC1的下游蛋白Nat1，而Nat1敲除导致小鼠胚胎期死亡及胚胎干细胞体外无法分化；于是他转向胚胎干细胞研究，找到多个干细胞特异表达基因，其中之一是Fbx15，并利用Fbx15敲除鼠建立筛选系统，最终幸运地筛选出iPS。
整形外科到博士阶段
山中伸弥高中时迷上柔道，因受伤频繁就医，在父亲建议下考入国立神户大学医学部，立志成为整形外科医生。然而，临床实习期间他发现自己缺乏手术天赋，且认为医生只能帮助少数患者，而医学研究若能取得成果，则可惠及更多人，因此转向基础医学研究。在大阪市立大学攻读博士期间，他主要研究血压调节的分子机理[1, 2]。研究过程中，他对小鼠基因敲除和转基因技术深感震撼，因此在申请博士后时，他优先选择运用这些技术的实验室。
博士后阶段——ApoBEC1
这位失败的整形医生最终被加州Gladstone Institute的Thomas Innerarity收归门下。Thomas实验室专注于血脂调节，与山中伸弥的博士研究有一定关联。他的新课题是研究ApoB mRNA的剪切蛋白ApoBEC1。
ApoB是低密度脂蛋白的主要成分。ApoB mRNA可被编辑酶ApoBEC1脱氨提前终止翻译，形成两种不同大小的蛋白：全长ApoB100和约一半长的ApoB48。经编辑的ApoB48在血浆中会被迅速清除。Thomas预测，若在肝脏中过表达ApoBEC1，血脂可能降低；若模型可行，未来或许可通过基因疗法帮助肥胖患者降低血脂。
山中伸弥一周七天勤奋工作，耗时六个月制成转基因鼠。一天早上，帮他维护小鼠的技术员告诉他：“Shinya，你的许多小鼠都怀孕了，可它们是公的。”他起初不信，到鼠房一看，果然许多公鼠腹部隆起。他处死几只后发现，小鼠患了肝癌，肝脏肿大撑大了肚皮。
ApoBEC1过表达后，低密度脂蛋白确实降低，但高密度脂蛋白升高，同时引发肝癌，得不偿失[3]。山中伸弥在一次讲座中总结了经验教训：第一，科学不可预测；第二，切勿在患者身上尝试新基因治疗；第三，或许最重要的是，不要轻信导师的假说。
Thomas对结果不符预期感到失望，但这一意外结果却激发了山中伸弥的好奇心：究竟是什么机制导致小鼠患肿瘤？幸运的是，Thomas足够开明，允许他偏离实验室主要方向，继续探索ApoBEC1的致癌机理。可以推测，ApoBEC1过表达后可能也编辑了ApoB以外的其他mRNA，找到这些mRNA或许能解释其致癌作用。
由于已知ApoBEC1需识别底物mRNA的特异序列才能编辑，山中伸弥据此设计引物扩增，找到了ApoBEC1的一个新底物——抑制蛋白翻译的基因Nat1。ApoBEC1过表达后，Nat1蛋白消失[4]。从逻辑上讲，若编辑Nat1是导致ApoBEC1致癌的关键分子，那么Nat1敲除的小鼠也应患癌。
基因敲除比转基因更复杂，需将构建的质粒原位整合到体外培养的胚胎干细胞中。这正是山中伸弥博士阶段梦寐以求的技术。他找到所里做基因敲除的专家、时任助理教授的Robert Farese，从其助手Heather Myers处学习了每个细节，并成功获得Nat1敲除的杂合鼠。Heather Myers成为他的终生好友；发现iPS后，山中伸弥公开表达了对她的感激，因为她曾告诉他，胚胎干细胞不仅是基因敲除的工具，其本身也是极具趣味的研究对象。
在山中伸弥兴致勃勃地继续探究Nat1功能时，他的妻子带着女儿返回日本。半年后，他决定中断研究，带着三只珍贵的Nat1杂合鼠，追随家人回国。
大阪的毛毛虫阶段——Nat1
凭借博士后期间发表的四篇高质量第一作者论文，1996年山中伸弥在母校大阪市立大学获得助理教授职位，继续Nat1研究。
然而，预测再次出现偏差：Nat1敲除后，纯合子小鼠在胚胎发育早期即死亡，无法观察成鼠是否患癌。进一步研究发现，敲除Nat1的胚胎干细胞在体外根本无法正常分化[5]。此时，他想起了Heather Myers的话：胚胎干细胞不仅是研究工具，其本身也是极具趣味的研究对象。他的关注点开始转向胚胎干细胞。
刚回大阪的头几年，由于起步阶段，他只能获得少量研究资助，不得不独自饲养数百只小鼠，日子十分艰苦。同时，大阪市立大学医学院基础研究薄弱，周围人不理解他研究Nat1在胚胎干细胞中的功能有何意义，总是劝他从事更贴近临床的研究。而Nat1的研究论文屡遭拒稿。种种压力与不得志，使他患上了一种自嘲的“PAD”（Post America Depression，离美后抑郁症），几乎要放弃科研，重操整形医生旧业。
在他最低谷时，两件事将他从PAD中挽救回来。其一是James Thomson（俞君英的导师，2007年几乎与山中伸弥同时宣布做出人iPS）于1998年宣布从人囊胚中采集并建立了胚胎干细胞系：这些干细胞在体外培养数月后仍可分化成不同胚层的细胞，如肠上皮细胞、软骨细胞、神经上皮细胞等[6]。这给了山中伸弥巨大鼓舞，使他更加坚信胚胎干细胞研究有意义，未来必将用于临床。其二是条件更优越的奈良先端科学技术研究生院看中了他的特长，招聘他建立一个基因敲除小鼠的设施，并授予副教授职位。
奈良的成蛹阶段——Fbx15
历经艰辛，山中伸弥终于拥有了自己的独立实验室。首次可以招收助手，令他兴奋不已。但问题随之而来：研究生生源有限，学生倾向于选择资历更老、条件更好的实验室。为吸引学生，他冥思苦想，提出了一个雄心勃勃的计划，声称实验室的远景目标是研究如何将终末分化的成体细胞逆转回多能干细胞。
当时科学界的主流是研究如何将胚胎多能干细胞分化成各种组织细胞，以替代受损或病变组织。山中伸弥认为自己的实验室无力与这些大牛竞争，不如反其道而行之，研究如何将分化细胞逆转为多能干细胞。
当时主流观点认为，哺乳动物胚胎发育中的细胞分化是单向的，如同时间不可逆转。但这一观点并非无懈可击：例如植物组织具有多能性，一些植物的茎插入土壤可重新长成植株；早在1962年，即山中伸弥出生那年，英国的John Gurdon爵士（与山中伸弥共享诺贝尔奖）报道了惊人发现：将蝌蚪的肠细胞核移植到去核蛙卵中，新细胞可发育成蝌蚪[7]。进一步地，为证明终末分化细胞核也具有全能性，他利用相同技术，用成蛙细胞核发育出蝌蚪，用胚胎期分化细胞核发育出可生育传代的成蛙[8, 9]。1997年，Ian Wilmut和Keith Campbell基于同样原理，将羊乳腺细胞核移植到去核羊卵中，成功培育出克隆羊多莉[10]。2001年，科学家发现，通过与干细胞融合，胸腺细胞核获得了很大程度的重编程[11]。
山中伸弥计划的第一步是找到尽可能多的、类似于Nat1参与维持干细胞功能的因子（维持因子指这些因子是胚胎干细胞在体外培养维持多能性所必需的）。他大胆推测，若过表达这些维持因子，或许可使终末分化细胞逆转为多能干细胞。一旦成功，诱导的多能干细胞将具备胚胎干细胞所不具备的优势：不仅绕开伦理问题，患者自身的诱导干细胞经改造后重新植入，由于是自体细胞，不会产生免疫排斥。
在这一远大前景感召下，山中伸弥成功“忽悠”了三名学生加入实验室。很快，他们鉴定出一系列在胚胎干细胞特异表达的基因，其中之一是Fbx15。学生Yoshimi Tokuzawa发现，Fbx15不仅特异表达于胚胎干细胞，还受另外两个胚胎干细胞维持因子Oct3/4和Sox2直接调控。山中伸弥对Yoshimi说：“Fbx15应参与维持干细胞多能性和胚胎发育，我猜你无法得到Fbx15敲除的纯合鼠。”Yoshimi构建质粒进行基因敲除，将染色体上的Fbx15基因通过同源重组替换为抗G418药物基因neo。
复杂的生命再次愚弄了山中伸弥：Fbx15敲除的纯合鼠活得健康，无明显表型。他又挑战学生：“好吧，Fbx15也许不是小鼠胚胎发育所必需，但它应是维持体外胚胎干细胞所必需的，我打赌你无法在胚胎干细胞中彻底敲除这个基因。”勤快的Yoshimi用较高浓度G418从干细胞中筛到纯合敲除株，细胞仍存活良好，无表型[12]。山中伸弥后来回忆时打趣道：“小鼠很happy，细胞也很happy，唯一不happy的就是可怜的学生Yoshimi了。”
但花费大量精力制作的敲除小鼠不能就此作罢。山中伸弥再次开动脑筋，想要废物利用。他发现，由于Fbx15仅在胚胎干细胞表达，Fbx15启动子操控的抗药基因neo在成体成纤维细胞中不表达，因此细胞对G418敏感；而敲除鼠的胚胎干细胞却可在高浓度G418中生长。若终末分化的成纤维细胞能诱导成胚胎干细胞，则会产生G418抗性。即便成纤维细胞仅获得部分胚胎干细胞特性，也应能抵抗低浓度G418。Fbx15敲除鼠实际上提供了极佳的诱导干细胞筛选系统！
京都大学的化蛹成蝶阶段——iPS
凭借鉴定胚胎干细胞维持因子的出色工作，2004年山中伸弥在名气更大的京都大学获得新职位。除了Fbx15敲除鼠筛选系统，他还积累了自身鉴定及文献报道的24个维持因子。他跃跃欲试，准备破壳而出，拍翅成蝶！
另一位学生Kazutoshi Takahashi此前已发表一篇关于干细胞致癌性的Nature文章。山中伸弥决定让他承担最大胆的课题——成体细胞逆分化，因为他知道，有Nature文章保底，即便接下来几年一无所获，学生也能承受。
即便有良好的筛选系统，该课题在当时看来仍极为冒险甚至不可行。当时普遍认为成体细胞已失去多能性，或许根本不可逆转。即便通过核移植技术实现了成体细胞核命运的逆转，那也只是细胞核，而非整个细胞。胚胎细胞与成体细胞染色体相同，细胞核具有全能性尚可理解，但实现细胞核逆转需借助卵细胞质中的大量蛋白。若要实现整个细胞命运的逆转，需使细胞质中所有蛋白重新洗牌。即便细胞可重编程，也应是众多蛋白共同参与。山中伸弥手中仅有24个因子，或许还有成百上千种因子被遗漏，缺少任何一种都可能无法实现重编程。根据已有知识，用这24个因子实现细胞重编程，从逻辑上讲可能性几乎为零。
Kazutoshi不顾这些，给成纤维细胞一一感染过表达这些因子的病毒，结果当然未筛选到任何抗G418细胞。山中伸弥知道如何保持学生斗志，他故作镇定地说：“你看，这说明我们的筛选系统很好，没有出现假阳性。”
在逐一尝试无果后，Kazutoshi大胆提出将24种病毒混合同时感染细胞。山中伸弥认为这想法很愚蠢：“没人这么干过，不过死马当活马医，你不嫌累就去试吧。”
几天后，奇迹发生了。培养板上稀稀疏疏地出现了十几个抗G418的细胞克隆！一个划时代的发现诞生了。
关键实验取得突破后，后续工作按部就班。Kazutoshi每次去掉一种病毒，将剩余23种混合感染成体细胞，观察克隆数量，以鉴别哪些因子是诱导干细胞所必需。最终鉴定出四个明星因子：Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4。这四个因子在成纤维细胞中过表达，足以将其逆转为多能干细胞！
抗G418的细胞克隆一定是多能干细胞吗？他们通过一系列指标，如基因表达谱、分化潜能等，发现这些细胞与胚胎干细胞高度相似。
2006年，山中伸弥报道了小鼠诱导干细胞，引起科学界轰动[13]；2007年，他在人细胞中同样实现了细胞命运逆转，科学界沸腾[14]。
展望
回顾种种不可能，山中伸弥为何能幸运成功？如今通过更多研究，我们认识到，干细胞特性的维持由基因网络共同作用，通过上调某些关键基因即可重建网络，逆转细胞命运；山中伸弥最终鉴定的四个因子并非必需，用其他因子组合也可达到同样目的。这好比一张大网，只需撑起几个支点，即可将整张网撑起。
iPS的发现意义非凡。首先，它更新了观念，人们不再认为细胞命运不可逆转，甚至可实现不同组织间的转分化。其次，iPS细胞绕过了胚胎干细胞的伦理困境，许多实验室可重复实验开展研究。第三，iPS细胞具有胚胎干细胞所不具备的优势：患者自身iPS细胞体外操作后重新植入，免疫反应大大减少；将患者体细胞逆转为iPS细胞，在体外分化观察疾病过程，可在培养皿中模拟疾病发生；疾病特异性iPS细胞体外扩增分化后，可用于筛选治疗药物或检测药物毒性。
但这仅是开始，生命科学如此复杂且不可预测，要将这些愿景变为现实，让iPS真正造福人类，仍面临重重困难。山中伸弥，这位科学的宠儿，怀着最初帮助更多患者的理想，无畏地踏上了新的征程。
注明：
作者本人并非研究iPS，错误在所难免，欢迎指正。
本文主要参考了山中伸弥在NIH的讲座。
参考文献
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3. Yamanaka, S., Balestra, M.E., Ferrell, L.D., Fan, J., Arnold, K.S., Taylor, S., Taylor, J.M., and Innerarity, T.L. (1995). Apolipoprotein B mRNA-editing protein induces hepatocellular carcinoma and dysplasia in transgenic animals. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 8483-8487.
4. Yamanaka, S., Poksay, K.S., Arnold, K.S., and Innerarity, T.L. (1997). A novel translational repressor mRNA is edited extensively in livers containing tumors caused by the transgene expression of the apoB mRNA-editing enzyme. Genes Dev 11, 321-333.
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