BioArt按：6月24日，BioArt推出国科大论坛专栏，旨在鼓励中国科学院大学（UCAS）生命学院的优秀本科生接触学术最前沿，激发他们对生命科学某些领域深层次的理解，同时也锻炼他们对科学报道的写作能力。今日BioArt推出第十七篇系列文章，这篇文章解读的是来自日本理化研究所（RIKEN）的科学家近日发表在Science杂志上题为Mitotic chromosome assembly despite nucleosome depletion inXenopusegg extracts的研究论文，研究者证明了在核小体缺失的情况下，集缩蛋白（condensins）也能将DNA组装成类似染色单体的松散结构；而集缩蛋白缺失时，即使有核小体存在，也只能形成不定型的聚集团。该研究建立了染色体形成的新理论，打破了核小体是有丝分裂过程中染色体形成时不可或缺的成分的这一传统认识。值得注意的是Science还同步配发了题为Building chromosomes without bricks的评论文章。

撰文丨彭皓（中国科学院大学2014级本科生）

导读

如果把一个人体细胞的DNA分子全部连接成一条并展开，总长度约为2米，这样一条长链要储存在不过几十微米大小的细胞核中，要经历复杂的压缩过程。有丝分裂过程中，DNA在蛋白质的辅助下压缩成棒状的染色体，保证了遗传物质被准确高效地分离到子细胞中。传统观点认为DNA链绕组蛋白八聚体组装是DNA压缩的第一步，核小体是有丝分裂过程中染色体形成时不可或缺的部分，但是日本科学家平野达也（Tatsuya Hirano）于2017年6月23日发表在Science上的文章《Mitotic chromosome assembly despite nucleosome depletion in Xenopus egg extracts》却挑战了这一观点。

研究背景

在染色体中，约200 bp的DNA与由H2A、H2B、H3、H4各两个分子形成的八聚体组成核小体，DNA缠绕在八聚体外，H1在核小体外。组蛋白占染色体中蛋白质总重的一半有余【2,3】，因此一般被认为是染色体形成的必要组件；但这个大家默认的观点其实并没有实验证明。另一种占比很大的蛋白质是集缩蛋白（condensins），已被证明是多种生物体内有丝分裂过程中构建染色体所必需的【4,5】。

为了探索这些蛋白质在有丝分裂过程中对染色体形成的贡献，研究者使用了非洲爪蟾卵的提取物制成的一个无细胞的系统【6】，在之前的研究中，将非洲爪蟾的精子核置于从细胞分裂中期的非洲爪蟾卵中获得的提取物中孵育，精子核将形成染色单体簇【5】。在这一实验中，研究者摒弃了无法去除H3和H4的非洲爪蟾精子核，选用几乎没有组蛋白的小鼠精子核，以尽可能排除干扰。

图1  将小鼠精子核制备成反应底物

文章解读

研究者首先将小鼠精子核和非洲爪蟾精子核分别置于非洲爪蟾卵提取物中孵育，发现小鼠精子核原先的泪滴状结构迅速散开，在5 分钟内变成了丝状结构，然后这些染色质丝逐渐增粗，最终变成清晰的棒状结构。非洲爪蟾精子核的变化类似。

图2  小鼠精子核的变化过程

核小体组装需要多个组蛋白伴侣的顺序介导，因此，研究者将在H3和H4组装过程中起关键作用的Asf1去除，获得Asf1缺失的非洲爪蟾卵提取物（ΔAsf1），该提取物不支持在裸露的环状DNA上的核小体组装。在这一步中就可以看出此实验换用小鼠精子核作为底物的高明之处，因为Asf1的去除并不影响非洲爪蟾精子核的染色体组装，非洲爪蟾精子核本身带有H3和H4，并且不需要Asf1介导。

将小鼠精子核在ΔAsf1卵提取物中孵育，令人惊讶的是，180分钟后，仍然出现了染色单体样结构。与空白对照（Δmock）相比，ΔAsf1中产生的染色单体形状不规则而且松散，由富含topo II（拓扑异构酶II）的DAPI致密的中心轴和周围模糊的染色质聚集团组成（下图）。进一步实验发现，ΔAsf1中产生的染色单体的DAPI分布范围更宽，而topo II的分布几乎不变，非组蛋白与Δmock中的几乎相同，组蛋白几乎没有；用微球菌核酸酶消化后，在组装在Δmock提取物中的染色单体中检测到对处理有抗性的单核小体大小的DNA片段，但在ΔAsf1提取物中组装的染色单体中检测不到；用脱氧核糖核酸酶I（DNase I）处理，发现ΔAsf1提取物中的产物更敏感，这意味着ΔAsf1提取物中的染色单体更加脆弱。

图3  小鼠精子核在Δmock和ΔAsf1中产生的结果

这部分实验表明在核小体几乎不存在的情况下，也可以产生类似有丝分裂染色单体的结构，但是由于实验中并不能完全去除Asf1，不排除有微量的核小体对组装过程起作用。

最后，研究者为了探究集缩蛋白（condensins）对染色单体组装的作用及其对核小体的依赖性，设置了Δmock空白对照，ΔAsf1、ΔcondI（去除集缩蛋白I）、ΔcondI-ΔAsf1（去除Asf1和集缩蛋白I）、ΔcondII（去除集缩蛋白II）和ΔcondII-ΔAsf1（去除Asf1和集缩蛋白II）共5个实验组。

结果发现，与Δmock组中形成的染色单体相比，ΔAsf1中的CAP-G（集缩蛋白I）有些扩散，CAP-H2（集缩蛋白II）仍然集中分布在中心轴上，即两种集缩蛋白对核小体都没有明显的依赖性。在没有集缩蛋白I的情况下（ΔcondI和ΔcondI-ΔAsf1），集缩蛋白II的分布并没有明显变化，即集缩蛋白II对核小体与集缩蛋白I均不依赖（下图）。但在没有集缩蛋白II的情况下（ΔcondII和ΔcondII-ΔAsf1），集缩蛋白I显示出核小体依赖性。由此可得，集缩蛋白II的组装能力独立于核小体和集缩蛋白I，但是集缩蛋白I要在集缩蛋白II的辅助下才能在无核小体的情况下完成组装。

图4  集缩蛋白对染色体组装的影响及其对核小体的依赖性

总结讨论

在这项研究中，研究者证明了在核小体缺失的情况下，集缩蛋白（condensins）也能将DNA组装成类似染色单体的松散结构；而集缩蛋白缺失时，即使有核小体存在，也只能形成不定型的聚集团。不过，集缩蛋白在进化上先于核小体出现，研究者对这一结果并不感到惊讶。研究者认为实验结果证明和扩展了先前的结论，而不是颠覆了传统观点，研究者猜测，在染色体组装过程中，DNA链与核心组蛋白八聚体形成核小体，集缩蛋白II使之变成有中心轴的松散结构，集缩蛋白I则促进染色体的侧向压缩。研究者认为，未来的研究重点在于集缩蛋白与核小体间的功能性串扰对染色体大规模构建的影响。此外，今后的研究还需要运用生物化学和生物物理所手段以及新的显微成像技术进一步的搞清楚集缩蛋白（condensins）在染色体形成过程中的精细调控方式。

染色体组装模型。图片引自Science配发的评论文章

参考文献：

1. Keishi Shintomi, Fukashi Inoue, Hiroshi Watanabe, Keita Ohsumi, Miho Ohsugi, Tatsuya Hirano, Mitotic chromosome assembly despite nucleosome depletion in Xenopus egg extracts.Science23 Jun 2017: Vol. 356,

2. S. Ohta, J.-C. Bukowski-Wills, L. Sanchez-Pulido, Fde. L. Alves, L. Wood, Z. A. Chen, M. Platani, L. Fischer, D. F. Hudson, C. P. Ponting, T. Fukagawa, W. C. Earnshaw, J. Rappsilber, The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics.Cell142, 810–821 (2010).

3. T. Hirano, T. J. Mitchison, A heterodimeric coiled-coil protein required for mitotic chromosome condensation in vitro.Cell79, 449–458 (1994).

4. T. Hirano, Condensin-Based Chromosome Organization from Bacteria to Vertebrates.Cell164, 847–857 (2016).

5. F. Uhlmann, SMC complexes: From DNA to chromosomes.Nat. Rev. Mol. Cell Biol.17, 399–412 (2016).

6. T. Hirano, T. J. Mitchison, Topoisomerase II does not play a scaffolding role in the organization of mitotic chromosomes assembled in Xenopus egg extracts.J. Cell Biol.120, 601–612 (1993).

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