二、肝硬变免疫细胞化学

　　肝硬变或称肝硬化（liver cirrhosis）是多种原因引起的慢性肝脏疾病，其中原因之一是和HBV慢性感染有关，特别在中国HBV可能是引起肝硬变的主要原因。HBV感染引起乙型肝炎，部分病例变成慢性活动性肝炎，进而转变成肝硬变。其中大部分为门脉性肝硬变（小结节　型肝硬变），小部分为坏死后性肝硬变（大结节　型肝硬变）。近年来在我国通过临床、病理及免疫病理的研究证明，HBV感染与肝硬变的发生有十分密切关系，在肝硬变内HBsAg检出率为70%～90%。世界其它一些国家和地区，如日本、印度、非州、香港等也有类似的报道。肝硬变的发生可能是由于机体免疫机能不足，不能将HBV完全杀灭和排除。在机体内HBV不断复制繁殖，并通过免疫机制使肝细胞反复遭受破坏，以及肝细胞结节　状再生，纤维组织不断增生，形成纤维隔，致使正常的肝小叶结构破坏，最后形成肝硬变。下面用免疫细胞化学（PAP），亲合免疫细胞化学（ABC）等方法对HBV抗原、纤维结合蛋白（FN）、III型胶原和细胞角蛋白在肝硬变组织内定位及分布进行描述。

　　（一）肝硬变组织内HBV抗原的定位及分布

　　用免疫细胞化学（PAP）及免疫亲合素（ABC）方法在肝硬变组织内对HBV抗原（HBsAg ,pre –S₁,pre-S₂,HBcAg HBxAg）进行了检测，观察了它们在肝细胞，kupffer 细胞内等定位和其分布状态。

　　1．HBsAg 、pre –S₁和pre-S₂在肝细胞内分布HBsAg在肝硬变组织中检测率为70%～80%，其中86%伴有肝细胞不典型增生；pre –S₁和pre-S₂的检出率为60%～70%，其中84%伴有肝细胞不典型增生。HBsAg 、pre –S₁和pre-S₂抗原经常出现于肝硬变组织的同一部位，甚至同一细胞内。少数情况下，HBsAg阳性,而pre –S₁或pre-S₂阴性，反之，HBsAg 阴性,而pre –S₁或pre-S₂阳性。HBsAg 、pre –S₁和pre-S₂抗原主要位于肝细胞浆内，部分位于膜上，少数位于核内。在部分肝硬变病例中，HBsAg 、pre –S₁和pre-S₂在也见于kupffer细胞内及肝内胆管上皮细胞内。

　　2．HBcAg 在肝细胞内的分布HBcAg 在肝硬变组织内的检出率为20%左右，其中82%伴有肝细胞不典型增生。HBcAg 阳性检出率明显低于HBsAg 、pre –S₁和pre-S₂，这可能是由于HBcAg 和抗-HBc在核内形成免疫复合物，以至HBcAg 被封闭之故。HBcAg 主要位于肝细胞核内的形态表现为分布与肝炎的相似。在少数病例HBcAg 阳性物质也见于汇管区的纤维组织内及肝窦壁上。

　　3．HBxAg 在肝细胞内的分布HBxAg在硬变组织的检出率为80%左右，其中85%伴有肝细胞不典型增生。HBxAg的检出率和HBsAg相似。HBxAg阳性物质呈细颗粒状。主要位于肝细胞浆内，少数位于胞核内及胞膜上。HBxAg在肝细胞内的形态表现及阳性细胞的分布状态与HBsAg相似。有部分病例HBxAg沿着肝硬变的纤维隔分布。HBxAg阳性物质也见于肝内胆管上皮细胞及kupper细胞内。

　　4．IgG(抗—HBc )在肝细胞内的分布在肝硬变组织内可观察到抗-HBc的存在，其阳性率与HBcAg相似。该抗体经常和HBcAg以复合物的形式存在于肝细胞核内，少数也见于胞浆内及膜上。抗-HBc阳性物质在肝硬变细胞内的存在和阳性细胞的分布状态与HBcAg相同。

　　（二）肝硬变组织内纤维结合蛋白（FN）的定位及分布

　　纤维结合蛋白（fibronectin, FN）是一个非胶原性的大分子糖蛋白。近年来研究发现它与损伤修复及器官硬化有密切关系。在肝硬变及慢活肝的组织内FN沉积增加，可能与肝硬变时纤维组织隔形成有关系。在肝硬变组织内，FN阳性物质位于肝细胞内及kupffer细胞内，其阳率分别为59%、65%。FN阳性物质弥漫分布于胞浆内，阳性细胞多呈三五成群地分布于假小叶边缘、中央静脉旁及肝实质内灶（片）状杯死区域的附近。汇管区及纤维隔内可见数量不等的FN阳性的组织细胞和纤维母细胞。此外。有的病例肝窦壁、血管内皮及小胆管基底膜也呈阳性反应。FN阳性检出率和HBsAg阳性呈正相关，在FN阳性病例中有80%HBsAg阳性。而活动性肝硬变FN阳性明显高于非活动性肝硬变（P<0.01）。上述结果表明，在由HBV感染引起的肝硬变过程中，FN参与了肝硬变的形成。

　　（三）肝硬变组织内III型胶原的定位及分布

　　在肝硬变时，I、III型胶原增加，这与肝纤维化有密切关系。实验结果证明，在惭性迁延性肝炎→慢性活动性肝炎→肝硬变之间，Ⅰ、Ⅲ型胶原的分布呈逐渐增加的趋势。除汇管区Ⅰ、Ⅲ型胶原增多外，中央静脉周围及小叶内坏死区、炎症区也增多，形成小叶内纤维化与从汇管伸向小叶内纤维组织相连形成纤维隔。在部分肝硬变病例，肝细胞内有Ⅲ型胶原阳性反应。在纤维隔及假小叶的窦壁上Ⅲ型胶原阳性率为100%，在肝细胞内为34%。Ⅲ型胶原在宽大纤维隔内呈弥漫密集分布，在窦壁上为连续线状分布，在肝细胞浆内呈弥漫分布。阳性肝细胞主要位于小叶边缘或近纤维隔处。动物实验证明Ⅰ、Ⅲ胶原是由肝细胞合成产生的，并参与肝硬变的形成。

　　（四）肝硬变组织内角蛋白定位及分布

　　在正常肝脏中肝细胞和胆管上皮细胞各有其特征性的细胞角蛋白（CK）组型，它们是各自形态发生的过程中建立的。研究结果表明在肝硬变组织中有81%呈角蛋白阳性反应，但阳性反应程度各病例是不相同的。CK阳性的肝细胞主要位于汇管区周围。尤其是碎屑状肝细胞坏死附近，并常伴有肝细胞小管状化生、弧立肝细胞团块形成及胆管或胆小管增生，它们之间在细胞形态和阳性强度上有移行关系，有的病例整个假小叶CK阳性。部分肝小多角型细胞也呈阳性反应。在肝硬变组织内CK阳性反应与HBsAg阳性呈正相关。CK阳性的肝硬变中绝大多数HBsAg也阳性，这一结果HBV感染所致的慢性肝脏病变可引起CK的异常表达。

　　三、肝癌免疫细胞化学

　　原发性肝细胞癌（简称肝癌）是世界上较常见的恶性肿瘤之一，特别在非洲和亚洲一些地区肝癌发病率较高。自从发现乙型肝炎抗原（HBAg）以来，给HBV与肝癌发病关系的研究开辟了新的途径。近年来用免疫细胞化学技术及分子杂交技术对HBV与肝癌发病关系的研究更加深入和广泛，并取得一定成果。全世界各地通过大量的流行病学、免疫病理学、分子遗传学等研究结果表明，HBV感染与肝癌的发病有密切关系，普遍认为HBV是肝癌发病的主要原因。目前尚不完全清楚HBV致癌机理，是具有直接致癌作用或间接致癌作用，这有待进一步研究。

　　（一）HBV与原发性肝癌的流行病学证据

　　HBV与原发性肝癌关系的研究已有20余年，目前对HBV作为肝癌病因的证据日益增多，特别是对HBV的分子生物学的研究表明，HBV可能具有直接致癌作用。如下事实可作为临床学和流行病学的证据：

　　（1）原发性肝癌常发生在HBV流行区，而非流行区则发病率很低。

　　（2）血清学研究表明：生活在HBV流行区的肝癌病人50%～90%HBsAg阳性，而对照组仅为5%～15%；抗-HBc为80%～90%，而对照组为15%～35%。近年来研究表明，肝癌病人抗-GBx的检出率在85%左右。而对照组很低。些标志物被认为是目前正在发生HBV感染或先前有HBV持续感染的证据。甚至在欧美肝癌发病率很低的国家，肝癌病人HBsAg，抗-HBc和抗-HBx检出率也明显比对照组高。从大量的研究结果表明，在HBV流行区HBV携带者肝癌发病的相对危险性比非携带者高十倍，甚至几百倍。

　　（3）在HBV流行的人群中，HBV携带者与肝癌家庭聚集性的早期观察，生活早期婴儿从母亲传播感染是HBV慢性携带者，后代亦易成为慢性携带者。Larouze 等发现塞内加尔患肝癌的母亲中71%HBsAg阳性，而相应的对照组仅为13%，在朝鲜和我国台湾省也观察到同样的现象。预防母-婴的HBV传播，对预防肝癌的发生具有重要意义，从研究家族病例来看，大多数最终发生肝癌的个体在出生时或是出生后第一年内从携带HBV的母亲或兄弟姐妹间获得感染。

　　（4）约80%的肝癌病例发生在肝硬变或慢性活动性肝炎的基础上，而肝硬变和慢性活动性肝炎双往往由HBV慢性持续性感染引起的。在亚洲和非洲一些地区，肝硬变病人90%以上HBsAg阳性，慢性活动性肝炎病人75%以上HBsAg阳性，而对照组只有6%～14%HBsAg阳性。

　　（二）肝硬变与肝癌的关系

　　大多数肝癌病合并有肝硬变，部分肝硬变病人可发展为肝癌，这一事实早已被人们所注意。大多数报道肝癌合并肝硬变为80%～90%。肝癌合并肝硬变的类型主要为坏死后大结节　型肝硬变，约占70%～80%，少数为混合型，合并小结节　型肝硬变少见。肝硬变发展为肝癌的百分率，各报道差别较大，但大多数报道为20%左右。坏死后大结节　型肝硬变与乙型肝炎病毒感染有密切关系，HBsAg阳性率很高，达70%～80%。Blumberg等（1977）报道在84例肝硬变中有24例HBsAg阳性，其中6例（25%）发展成肝癌。Obata(1980)指出，HBsAg阳性的肝硬变有23%发生癌变，Nayak（1977）报道，肝硬变发生癌变的机会和其HBsAg阳性有关，HBsAg阳性的肝硬变发生肝癌的机会为51%，而与HBsAg阳性的大结节　型肝硬变有密切关系。大结节　型肝硬变常伴有肝细胞的不典型增生，而伴有不典型增生的肝硬变HBsAg阳性检出率很高，表明肝细胞不典型增生与HBsAg慢性持续感染有密切关系。有人认为不典型增生的肝细胞是一种癌前期病变。

　　（三）肝细胞肝癌及癌周肝组织内HBV抗原的分布

　　目前用组织化学、免疫组织化学及免疫电镜等技术可以在人肝癌及癌旁肝细胞内检测到HBsAg、前S₁、前S₂、HBcAg(HBeAg)及HBxAg等。

　　1．肝癌及癌周肝组织内HBsAg定位及分布在肝癌组织内，HBsAg阳性率一般来说比较低，大多数报道其阳性率在10%～15%，少数报道阳性率可高达25～44%。肝癌细胞内HB－sAg阳性主要见于分化好的肝癌病例，少数亦见于中度分化及分化差的肝癌病例。一般来说，癌周肝组织内HBsAg阳性率明显高于癌组织。大多数文献报道，癌周肝组织内HBsAg阳性率为60%～80%，少数报道在90%以上。癌周肝组织内HBsAg阳性主要见于癌周肝硬变中，特别是大结节　肝硬变中。这一结果表明，HBV与肝癌的发生有密切关系。肝癌及癌周肝组织内HBsAg阳性的形态和分布状态，不同病例表现不同，就是同一病例不同部位也有很大差异。HBsAg阳性细胞分布亦不规律。绝大多数HBsAg阳性物质位于胞浆内，部分位于胞膜上，少数位于核内。HBsAg阳性物质呈细颗粒状、絮状或网状。HBsAg阳性物质在细胞内分布有三种类型：全胞浆型，阳性物质充满整个胞浆；包涵体型，阳性物质集聚成团，位于核旁一侧；胞周型或核周型，阳性物质沿着泡膜或核膜分布，呈环状。在肝癌及癌周肝组织内包涵体型或全胞浆型较多见。HBsAg阳性细胞的分布有三种类型：弥漫型，多数阳性细胞弥漫分布于切片内；局灶型，少数阳性细胞集聚于某一区域；散在型，阳性细胞较少，孤立的或零散的分布于切片内。一般来说，癌周肝组织HBsAg阳性反应强度和阳性细胞检出率比癌组织高。癌组织检出率低的原因，可能是由于癌组织不适于HBsAg的复制，或是由于HBv DNA和宿主DNA发生整合，而HBsAg不易表达所致。至于HBsAg在肝癌发病中的作用，目前尚不清楚。一般认为HBsAg作为靶抗原，通过免疫反应，造成肝细胞的损伤，肝细胞增生，不典型增生，最终可能导致癌变。

　　2．肝癌及癌周肝组织内前S抗原的定位及分布对肝癌及癌周肝组织内前S（pre-S₁和pre-S₂）抗原的研究远不及对HBsAg的研究。近来，国内外文献有少数报道。在肝癌组织内前S₁和前S₂抗原的检出率为20%左右，略比HBsAg检出率高。在癌周肝组织前S₁和前S₂抗原的检出率为60%左右，这个和HBsAg的检出率基本相似。在绝大多数HBsAg阳性的病例前S₁和前S₂抗原亦阳性，而在部分前S₁和前S₂阳性病例，HBsAg却呈阴性反应。因为在基因构成上，前S₁包括前S₂和HBsAg，前S₂包括HBsAg的部分，故前S₁和前S₂的表达要比HB－sAg强。用免疫组化方法染色，前S₁和前S₂阳性物质呈棕红色呈均匀细颗粒状，主要位于癌细胞及肝细胞的胞浆内，有些病例则和/或位于胞膜上及核内。阳性物质反应的强弱和前S₁或前S₂抗原的含量有关。一般来说，前S₁或前S₂阳性反应强度和阳性细胞检出率，癌周肝组织比癌组织强。这一规律和HBsAg相同。前S₁或前S₂阳性物质在细胞内的分布情况及其阳性细胞分布状态和HBsAg的基本相似。目前对前S₁或前S₂抗原在肝癌发病中的作用尚不完全清楚。有人研究证明，在人肝细胞膜上存在两种不同的受体，一种受体可以直接与前S₁蛋白结合；另一种受体通过多聚人血清白蛋白（PHSA）与前S₂蛋白结合。所以HBV通过PHSA介质结合在肝细胞上，从而形成靶抗原，通过免疫反应引起肝细胞的损伤，进而可能发生肝细胞的增生，不典型增生，最终导致癌变。