3．肝癌及癌周肝组织内HBcAg(HBeAg)的定位及分布到目前为止，在肝癌细胞内发现有HBcAg只有少数报道。所有的报道，HBcAg的检出率都不太高，大多在10%～20%左右。HBcAg和HBeAg在肝癌及癌周肝组织内不易检出或检出率较低的原因，可能是由于HBcAg 和抗HBc常以免疫复合物的形式存在于胞核内，HBcAg被封闭之故；亦可能由于HBcAg基因和宿主基因进行了整合，使HBcAg不再表达出来。HBcAg和HBeAg经常并存，因此HBeAg亦经常不易单独检出。HBcAg或HBeAg阳性物质呈均匀细颗粒状分布于胞核内，少数见于核仁内。位于核内常呈圆形或卵圆形，围绕核仁占据整个核或占据核的大部分。少数病例HBcAg阳性物质位于胞浆内或胞膜上，有的病例核、膜及浆内同时阳性。HBcAg阳性细胞的分布与HBsAg的分布相似。

　　关于肝癌的免疫学方面的研究，血清学方面的研究较多，组织学研究的较少。大量的流行病学和临床学方面的资料表明，肝癌患者血清中抗-HBc明显高于对照组，其阳性率高达70%～95%。用免疫组化技术在肝癌及癌旁肝组织内亦发现有抗-HBc的存在。有人证实抗-HBc为IgG，这种IgG经常和HBcAg以复合物的形式存在于细胞核内，少数也见于胞浆及胞膜上。并证实，IgG只见于含有HBcAg的胞核内，而无核内HBcAg，就无抗-HBc存在。因此，如果能测出IgG（抗-HBc），也就间接地证实了HBcAg的存在。IgG(抗-HBc)阳性呈圆形或卵圆形位于核内或以包涵体位于胞浆内。IgG阳性细胞的分布状态和HBcAg的分布相同。IgG(抗-HBc)在肝癌发病中起何作用，目前尚不清楚，有人认为IgG和HBcAg形成免疫复合的，由于免疫反应，在慢性活动性肝炎发病中和肝硬变形成中起重要作用，而慢活肝和肝硬变又是肝癌发生的重要环节　。HBcAg和抗-HBc形成的免疫复合物是否为癌变的始动因素，还有待进一步研究。

　　4．肝癌及癌周肝组织内HBxAg的定位及分布近年来，对HBV分子生物学研究发现了HBV另一种抗原，即HBxAg。HBxAg和肝癌发生的关系密切，已引起人们广泛的重视。目前，国内外已有少数文献报道关于HBxAg和肝癌发病的关系的研究。在人原发性肝癌组织内HBxAg的检出率大约为60%～80%，这明显高于HBsAg的检出率。在癌周肝组织内HBxAg阳性检出率在70%～80%，这和HBsAg的检出率基本相似。用PAP或ABC方法检测HBxAg，其阳性物质呈棕褐色均匀细颗粒状，主要位于癌细胞和肝细胞胞浆内，部分病例除胞浆阳性外，胞膜或核亦阳性（约20%），单独膜型或核型少见。不同病例HBxAg阳性物质的分布及阳性反应强度是不同的，就是同一病例不同部位，其结果也不尽相同。一般来说，癌周肝组织内HBxAg阳性检出率及阳性反应强度比癌组织内高。其反应强弱与HBxAg含量多少有关。HBxAg阳性细胞分布与HBsAg阳性细胞分布相似，亦分为散在型，局灶型和弥漫型。在癌周硬变组织内，HBxAg阳性细胞有时围绕小血管分布。有的则沿着纤维膈分布。在HBxAg阳性病例，有24%在癌组织内伴有HBsAg和/或HBcAg，有72%在癌周肝组织内伴有HBsAg和/或HBcAg。HBx－Ag在肝癌发病中的作用，目前尚不完全清楚。有人报道在肝癌患者血清中含有较高的抗-HBx，其检出率高达85%。Miyaki等（1986）发现在所检查的原发性肝细胞癌组织中都存在和HBV的X基因相同的DNA序列。有些作者认为，宿主细胞DNA和HBv DNA的整合是通过X基因区特殊的重组来完成的，其翻译产物-HBx蛋白（HBxAg）对癌基因具有反式激活作用，而引起细胞癌变。最近有人通过HBV的X基因在转基因小鼠中诱发肝癌的动物实验证明，HBx蛋白能够改变宿主基因的表达，并导致肝细胞癌的发生。因此，有些作者认为HBxAg在肝癌发生中具有重要作用，并认为HBV可能具有直接致癌作用。

　　（四）肝内胆管细胞癌及癌周肝组织内HBV抗原的分布

　　在原发性肝癌中，最常见的是肝细胞肝癌，而肝内胆管细胞癌比较少见，在我国大约为10%。长期以来，人们对肝内胆管细胞癌的病因及发病机理研究甚少，认识不清。早年候宝璋曾报道，胆内提管细胞癌的发生与中华分枝睾吸虫感染有关。最近有文献报道，在肝内胆管细胞癌及其癌周肝组织内检测出HBv 5中抗原（HBsAg、pre-S₁、pre-S₂、HBxAg和HBcAg），而且检出的阳性率很高。王文亮等报道（1993），在20例肝内胆管细胞癌中，HBxAg阳性检出率为75%，pre-S₁和S₂各为40%，HBsAg为10%；在19例癌周肝组织中，HBxAg阳性检出率为84%，pre-S₁和S₂各为47%，HBsAg t HbcAg分别为32%。在20例肝内胆管细胞癌的病例中有17例（85%）有不同HBV抗原的表达，其中HBxAg阳性检出率为80%。这一结果表明，肝内胆管细胞癌的发生与HBV感染有密切关系。HBV5种抗原在肝内胆管细胞癌及其癌周肝组织内的阳性反应及阳性细胞分布状态与肝细胞肝癌相同。肝内胆管细胞癌的发病过程可能与肝细胞肝癌不完全相同。肝细胞肝癌80%伴有肝硬变，特别是大结节　型肝硬变。一般认为大多数肝细胞肝癌是由于HBV感染→慢性肝炎→肝硬变→肝癌。而肝内胆管细胞癌很少伴有肝硬变，它的发生过程主要不是通过肝硬变这一重要环节　，而是由慢性肝炎，肝细胞不典型增生或中间型细胞演变为肝癌。HBV是否有直接致癌的作用尚有等进一步研究。

　　（五）肝细胞癌中的HBV的分子生物学

　　近10年来，国内外对原发性肝细胞癌中乙型肝炎病毒DNA的存在，分布及意义进行了广泛的研究，并取得了可喜的成果。用southern blot 分子杂交技术及原位分子杂交技术，在肝癌患者血清中和肝癌组织中检测HBV-DNA的分布状态。用HBV-DHA基因或其亚基因标记同位素（³²P、³⁵S等）及生物素地高辛等作为探针和肝癌及癌旁肝组织中的DNA进行杂交，通过放射自显影法检测HBV-DNA存在状态（是整合或游离）；原位分子杂交经过染色反应观察细胞内HBV-DNA的定位和分布状态。有人用southern blot方法检测肝癌病人血清中HBV-DNA的情况，只有少数病例血清中有微量的HBV-DNA，则慢性乙型肝炎患者血清却多为阳性，提示在HBsAg阳性肝癌病人血清中很少或没有可测出的HBV-DNA。目前，国内外已有不少文献报道，在肝癌组织中有整合的HBV-DNA。例如，Shafritz等（1981）检测了20例来自南非的肝癌患者，有15例HBV-DNA整合人宿主细胞DNA中，其中12例HBsAg阳性，3例HBsAg阴性而抗-HBs阳性。Tiollais（1981）检查了15例来自欧洲的肝癌标本，HBsAg或抗-HBs阳性病例，检查结果HBV-DNA均以整合形式存在。他们还观察了32例HBsAg阳性的肝癌病人，结果证明在所有肝癌组织中均有HBV-DNA。国内大多数报道在肝癌组织中HBV-DNA检出率为60%～80%。上述结果表明，人原发性肝细胞癌的发生和HBV感染有极为密切关系。

　　（六）肝癌发生中HBV分子遗传学及免疫机理

　　免疫病理学及分子生物学的研究表明，HBV不仅有间接致肝癌作用，而且还可能有直接致癌作用。HBV致癌作用的分子机理目前集中对于HBV的分子遗传学和分子免疫学的研究。在原发性肝细胞癌发生中，HBV致癌作用可能有两个模式：一是病毒的癌基因模式，就是表达病毒的癌基因（HBV-DNA）；另一个是细胞癌基因模式，在肝细胞癌变过程中，细胞癌基因可能发生启动子插入，染色体异常（缺失、重复、易位）及点突变等。研究证明，机体感染HBV后，HBV将其本身的基因掺入到肝细胞核内，和宿主细胞基因发生整合，从而使正常的肝细胞转变为癌细胞。这需要经过一个复杂的演变过程。在肝癌的HBV-DNA整合部位，常发生染色体缺失、重复或易位。Slagle等（1990）研究发现，有44%的肝细胞癌病人发生染色体的丢失，而17P的丢失常包括抑癌基因P⁵³的丢失，这可能是肝细胞癌发生的原因。Blum（1985）认为在HBV-DNA整合位点附近宿主细胞基因有重排现象。Tiollais等认为病毒DNA整合人宿主细胞DNA或与DNA发生重排，产生HBV激活的基因或激活细胞的原癌基因，进而导致细胞的转化，最终发生肝癌。有人通过实验研究证明病毒插入到细胞原癌基因附近，作为一种诱变剂，可能直接参与肝细胞癌的发生。Seifter等（1990）在体外进行X基因的转化实验，将HBV-DNA或X基因序列连在SV₄₀早期启动子的加强子上，用以转化传代鼠肝细胞及传代鼠纤维母细胞，转染成功的能稳定复制HBV的肝细胞表现出恶性生长的特征，将其接种裸鼠，显示出致癌性，并激活细胞原癌基因c-fos过量表达。这提示，HBV-DNA含有致癌基因序列，可以促进细胞向恶性转化。HBV基因组中编码加强子和X蛋白的碱基序列也有某些致癌活性。尽管如此，到目前为止，HBV致癌的分子机理尚不完全清楚，有待进一步研究。

　　（王文亮）

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