简介

Western blot是一种常用的蛋白质检测技术，用于分析特定蛋白质的表达水平和分子量。本文详细介绍了从植物叶片中提取可溶性蛋白质并进行Western blot实验的具体步骤。

实验步骤

1. 蛋白质提取与电泳：从植物叶片中提取可溶性蛋白质后，样品通过SDS-PAGE凝胶进行电泳分离。该步骤采用Sambrook等人（1989年）的SDS-PAGE方法。

2. 转膜：电泳后，将PAGE凝胶在转移缓冲液（25mM Tris/192mM甘氨酸，含15%甲醇，pH 8.2）中平衡20分钟。切割适当大小的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（PVDF-Plus，Micron Separations Inc.，美国），在100%甲醇中预湿5秒，然后在蒸馏水中清洗5分钟，再在转移缓冲液（500mL）中平衡15分钟。使用BioRad Mini Protein II转移设备在4°C、60V条件下转移蛋白1小时。

3. 膜处理：转膜后，将膜在pH 7.6的Tris缓冲盐溶液（TBS）中清洗5分钟。接着，将膜置于含有5%脱脂奶粉和0.1%（v/v）Tween20的TBS缓冲液中孵育1小时。随后，分别用相同的奶粉/TBS/Tween溶液清洗三次，每次10分钟；再用仅含0.1% Tween20的TBS（TTBS）清洗10分钟。

4. 抗体孵育：将膜置于含有5%脱脂奶粉的TTBS溶液中，加入一抗，在室温下使用轨道式摇床孵育过夜。随后，用TTBS溶液清洗膜四次，每次10分钟。

5. 检测：使用ECL Plus Western Blotting检测系统（Amersham Pharmacia Biotech，英国）进行检测。将膜放入含有辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗和5%脱脂奶粉的TTBS溶液中，孵育2小时。随后，用TTBS溶液清洗四次，每次10分钟。将2mL含有Lumigen PS-3荧光底物的检测试剂滴加到膜上，在室温下孵育5分钟。然后，将膜边缘轻触吸水纸以去除多余检测试剂。

6. 显影：将膜用保鲜膜包裹后放入X光胶片盒中。在暗室红光条件下，将一张放射自显影胶片（Hyperfilm ECL，Amersham Pharmacia Biotech）覆盖在膜上。曝光后，冲洗胶片并进行显影、清洗和固定。

注意事项

• 确保PVDF膜在转移前完全湿润，以确保蛋白质能够有效结合。
• 在孵育抗体时，使用轨道式摇床以确保溶液均匀覆盖膜表面。
• 在显影过程中，避免光线直射，以免影响检测结果。