描述

本文介绍了一种基于荧光检测的半胱氨酸蛋白酶活性测定方法。该方法使用了特异性半胱氨酸蛋白酶底物Z-Phe-Arg-MCA，根据Barret和Kirschke（1981）的描述进行实验。该底物Z-Phe-Arg-NMec本身几乎不具有荧光，但在反应停止后会水解生成具有强荧光的7-氨基-4-甲基香豆素，通过荧光检测其释放量来量化酶活性。

实验步骤

1. 从粗叶提取物中提取总可溶性蛋白（50 µg），并用0.1% Tween 20溶液稀释至总体积500 µL。

2. 向上述溶液中加入250 µL的蛋白酶反应缓冲液（340 mM醋酸钠、60 mM醋酸、4 mM二钠EDTA和8 mM DTT）。

3. 将溶液置于30°C下平衡1分钟以激活酶。

4. 加入250 µL 20 mM的半胱氨酸蛋白酶底物Z-Phe-Arg-NMec溶液（溶解于二甲基亚砜中）。

5. 在30°C下反应10分钟后，加入1 mL终止试剂（100 mM单氯乙酸钠、30 mM醋酸钠、70 mM醋酸，pH 4.3）。

6. 使用荧光分光光度计测定自由7-氨基-4-甲基香豆素的荧光，激发波长为370 nm，发射波长为460 nm。

注意事项

- 确保所有试剂的纯度符合实验要求。

- 在实验过程中保持恒定的温度以确保结果的准确性。

- 使用新鲜配制的试剂以避免实验误差。