PP2C酶活性测定是一种用于检测PP2C磷酸酶活性的实验方法，主要涉及酪蛋白的磷酸化和随后的PP2C介导的去磷酸化过程。

实验步骤

1. 酪蛋白的磷酸化

使用酪蛋白激酶I（CKI）对酪蛋白进行磷酸化。反应条件包括50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10 mM MgCl₂、5 mM DTT、2.5 mg部分去磷酸化的酪蛋白、3000 U CKI和500 μCi γ-³²P-ATP。在30°C下反应4小时后，通过TCA沉淀测定掺入效率。

2. 原生质体裂解缓冲液（PLB）的制备

PLB包含20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、20 mM KCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、10 mM DTT、0.5% Triton X-100和50%甘油。在使用前添加蛋白酶抑制剂（如抗痛素、亮抑酶肽、胃蛋白酶抑制剂和PMSF）。

3. PP2C反应

使用2-10 μl玉米原生质体提取物或1-2 μl大肠杆菌提取物，在50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10 mM MgCl₂和5 mM DTT的条件下进行反应。反应在30°C下进行30分钟（原生质体提取物）或15分钟（大肠杆菌提取物）。

4. 酪蛋白激酶活性测定

类似于酪蛋白磷酸化步骤，但使用细胞提取物代替纯化的CKI。

5. 使用大肠杆菌细胞提取物进行PP2C测定

将PP2C克隆到pET19b载体中，在BL21细胞中表达。通过IPTG诱导表达后，裂解细胞并使用提取物进行PP2C活性测定。