本文介绍了一种用于检测体外培养细胞DNA合成的实验方法,通过使用放射性标记的H-胸腺嘧啶(H-Thymidine)来追踪细胞增殖。该方法适用于小鼠成纤维细胞(L细胞)或鸡胚成纤维细胞。
实验步骤如下:
1. 将细胞培养在盖玻片上,给予H-胸腺嘧啶进行短期标记。
2. 标记结束后,用PBSA缓冲液清洗盖玻片,去除未掺入的标记物。
3. 用戊二醛固定细胞15分钟,随后用蒸馏水和2%高氯酸(PCA)反复清洗,去除残留的标记物。
4. 盖玻片背面用滤纸干燥,细胞面向上安装在涂有染色铝胶(CAG)的载玻片上,使用Permount封片。
5. 在暗室中,将载玻片浸入核径迹乳胶(如Kodak NTB-3)中,于28°C下暗处干燥至少1小时。
6. 显影过程使用Dektol显影液(1:2稀释)在18°C下进行90秒,随后用摄影定影液固定,并用Giemsa染色。
7. 显微镜下观察银粒簇的分布,计算标记细胞的比例及每个细胞的银粒数量,绘制直方图分析结果。
关键试剂配方包括:PBSA缓冲液、5%戊二醛、2%高氯酸、染色铝胶涂布的载玻片、核径迹乳胶、显影液及Giemsa染色液等。