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体外培养细胞中H-胸腺嘧啶掺入的实验方法

2006-07-24 14:11 未知 未知 阅读 0
核心摘要: 本文详细介绍了体外培养细胞中H-胸腺嘧啶掺入的实验方法,通过放射性标记追踪DNA合成,适用于研究细胞增殖机制。实验步骤包括细胞培养、标记、清洗、固定、显影及显微分析,为细胞生物学研究提供标准化技术流程。

本文介绍了一种用于检测体外培养细胞DNA合成的实验方法,通过使用放射性标记的H-胸腺嘧啶(H-Thymidine)来追踪细胞增殖。该方法适用于小鼠成纤维细胞(L细胞)或鸡胚成纤维细胞。

实验步骤如下

1. 将细胞培养在盖玻片上,给予H-胸腺嘧啶进行短期标记。

2. 标记结束后,用PBSA缓冲液清洗盖玻片,去除未掺入的标记物。

3. 用戊二醛固定细胞15分钟,随后用蒸馏水和2%高氯酸(PCA)反复清洗,去除残留的标记物。

4. 盖玻片背面用滤纸干燥,细胞面向上安装在涂有染色铝胶(CAG)的载玻片上,使用Permount封片。

5. 在暗室中,将载玻片浸入核径迹乳胶(如Kodak NTB-3)中,于28°C下暗处干燥至少1小时。

6. 显影过程使用Dektol显影液(1:2稀释)在18°C下进行90秒,随后用摄影定影液固定,并用Giemsa染色。

7. 显微镜下观察银粒簇的分布,计算标记细胞的比例及每个细胞的银粒数量,绘制直方图分析结果。

关键试剂配方包括:PBSA缓冲液、5%戊二醛、2%高氯酸、染色铝胶涂布的载玻片、核径迹乳胶、显影液及Giemsa染色液等。

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