细胞内细胞因子染色技术是一种基于免疫荧光染色和流式细胞术分析的改良协议，可用于在单细胞水平上同时分析表面分子和细胞内细胞因子。在该协议中，细胞首先在体外激活，按照常规染色协议对表面抗原进行染色，然后固定和透化，以允许抗细胞因子抗体对细胞内进行染色。由于新鲜制备的细胞中细胞因子水平通常过低，因此通常需要对细胞进行体外刺激才能通过流式细胞术检测到细胞因子。细胞的刺激方式取决于细胞类型和实验条件。例如，为了刺激T细胞产生IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-4，可以使用PMA（一种PKC激活剂）和Ionomycin（一种钙离子载体）或抗CD3抗体的组合。为了诱导单核细胞产生IL-6、IL-10或TNF-α，可以使用LPS刺激PBMC。

实验流程

1. 制备目标细胞。
2. 按照表面染色协议对细胞表面抗原进行染色，表面标记的选择取决于实验问题。
3. 最后一次洗涤后，在涡流管中加入100 μL固定液固定细胞，在室温下避光孵育20分钟。
4. 加入1 mL透化缓冲液，离心5分钟，吸出上清液。
5. 重复步骤4。
6. 在100 μL透化缓冲液中重悬细胞，在室温下避光孵育5分钟。
7. 将荧光染料标记的抗细胞因子单克隆抗体稀释至最佳浓度，加入20 μL透化缓冲液中，然后加入相应的管中，涡流混合。适用于此应用的共轭抗体的良好范围为0.5-0.06 μg/10^6细胞。eBioscience荧光染料标记的抗细胞因子抗体也可用于20 μL/测试尺寸。如果使用这些试剂，请将20 μL预滴定的抗体加入相应的管中。
8. 在室温下避光孵育20分钟。
9. 加入1 mL透化缓冲液，离心5分钟，吸出上清液。
10. 在0.5 mL流式细胞术染色缓冲液中重悬细胞沉淀物。
11. 在流式细胞仪上运行并分析。