描述

本文介绍了一种用于酵母细胞的免疫荧光染色程序，旨在帮助研究人员观察细胞内特定蛋白质的定位和表达情况。

步骤

1) 在YEPD或定义培养基中培养细胞至浓度为1-5 × 10⁷（该协议适用于约5毫升的指数生长期细胞）。

2) 向细胞中直接添加0.6毫升37%甲醛溶液，并在与生长相同的温度下轻轻摇动孵育90分钟。

3) 将细胞转移至15毫升锥形管中，离心沉淀（3分钟，2000转/分钟）。

4) 吸去上清液，用5毫升0.1 M KPO₄（pH 6.5）洗涤细胞。

5) 重新沉淀细胞，并用5毫升0.1 M KPO₄（pH 6.5）/1.2 M山梨醇（P溶液）洗涤。

6) 沉淀细胞并吸去上清液。重悬于约1毫升P溶液中。

7) 添加25微升DTT，孵育10分钟，然后添加25微升酵母酶。将细胞在30℃的滚筒上孵育一小时（或直至消化充分）。

8) 沉淀细胞并吸去上清液。重悬于约1毫升P溶液中。

9) 将20微升细胞悬液放入每个预先准备好的载玻片孔中。几分钟后吸去多余的细胞。

10) 立即将载玻片浸入冰冷的甲醇中6-7分钟。取出后，浸入冰冷的丙酮中30秒。让载玻片自然干燥。

*一旦细胞固定，尽量保持孔内湿润。

11) 用10毫克/毫升BSA在1X PBS中洗涤载玻片一次。去除上清液，添加稀释于BSA/PBS中的一抗，至少在潮湿的环境中孵育2小时。

12) 吸去多余的溶液，使用BSA/PBS洗涤4次。添加20微升稀释于BSA/PBS中的二抗，放置在黑暗潮湿的环境中约2小时。

*记得保持载玻片覆盖，以防止二抗褪色。

13) 吸去多余的液体，在BSA/PBS中洗涤3次。然后用1X PBS洗涤一次。将DAPI（1:1000）稀释于1X PBS中，加入孔中并孵育几分钟。吸去多余的液体，洗涤一次1X PBS，让载玻片自然干燥。

14) 用抗褪色试剂覆盖孔，并加盖玻璃片，用透明指甲油密封。

配方

0.1 M KPO₄（pH 6.5）
0.1 M KPO₄（pH 6.5）/1.2 M山梨醇（P溶液）
酵母酶-在P溶液中制备10毫克/毫升的溶液，涡旋后在台面上静置5分钟。然后在离心机中离心5分钟，使用清澈的上清液。
10毫克/毫升BSA在1X PBS中
1X PBS
抗褪色溶液-对苯二胺（1晶体在100微升10X PBS中，然后加入900微升甘油）

材料

（此处列出所需材料）

提示

载玻片准备：
用0.1%聚赖氨酸涂覆载玻片孔。10-30秒后吸去。用水洗涤每个孔三次。让载玻片自然干燥10分钟。