本文介绍了一种从培养的人类单核细胞中快速提取未降解蛋白质的实验方法，以用于免疫印迹分析。

实验步骤

1. 按照常规方法从Buffy Coats中分离PBMCs，并使用抗CD14磁珠（Miltenyi Biotec提供的协议）选择CD14+单核细胞。

2. 将单核细胞在RPMI培养基（含10%胎牛血清和25ng/ml人类MCSF）中过夜培养，密度为每孔400万个细胞（六孔培养板）。

3. 次日，在对单核细胞进行任何处理后，收获前5分钟每孔加入5ul PefaBlock（Roche公司产品），将培养板置于冰上，吸出培养基，并加入150ul常规SDS-PAGE样品缓冲液（含蛋白酶抑制剂混合物，Roche公司产品）。

4. 吸出培养基后立即加入样品缓冲液，逐孔操作，以避免蛋白质提取前发生人工磷酸化/去磷酸化事件。用刮刀彻底刮取细胞约10-15秒，将提取液转移到Eppendorf管中，涡旋混匀几秒，9000rpm离心2分钟，收集上清液至新管中，沸水浴5分钟。

5. 在Criterion（Biorad）凝胶上每条加载15ul样品，蛋白质量约为30-50ug。

注意事项

PefaBlock是一种细胞可透性蛋白酶抑制剂，可在收获细胞前渗透入细胞，是PMSF的良好替代品。