描述

本文介绍了一种用于检测SCCA1和SCCA2的夹心ELISA（酶联免疫吸附测定）方法。

实验步骤

1. 将亲和纯化的兔抗SCCA抗体以1:400的比例稀释于PBS中（每批亲和纯化后需确定该抗体的适当稀释比例）。将100μl稀释后的抗体加入96孔ELISA板的每个孔中（使用Becton Dickinson and Company的Probind）。在室温下孵育1小时。
2. 用PBS/0.1% Tween洗涤板子3次。用PBS/0.1% Tween/1% BSA在室温下孵育孔，阻止非特异性蛋白吸附，孵育1小时。
3. 在阻断溶液中准备GST/SCCA1或GST/SCCA2的1:4系列稀释，浓度分别为200、50、12.5、3.12、0.78 ng/ml。在Eppendorf管中准备稀释液，然后将100μl（如果样品量有限则为50μl）转移到板上，重复两次，室温孵育1小时。
4. 用PBS/0.1% Tween洗涤板子3次。
5. 将小鼠单克隆抗体8H11（抗SCCA1单抗，来源于小鼠腹水）以1:4000的比例或10C12（抗SCCA2）以1:1000的比例稀释于阻断溶液中。将100μl加入每个孔中，室温孵育1小时。
6. 用PBS/0.1% Tween洗涤板子3次。
7. 将HRP标记的山羊抗小鼠IgG按照适当比例稀释于阻断溶液中。将100μl加入每个孔中，室温孵育1小时。
8. 用PBS/0.1% Tween洗涤板子3次。
9. 将1片OPD底物溶解于5ml OPD稀释液中（Abbott）。将50μl加入每个孔中，孵育至标准品出现黄色后，用250μl/well的1.25 M H2SO4终止反应，确保“零”抗原孔未发生颜色变化。
10. 在492 nm处读取吸光度。使用Softmax软件（Molecular Devices）根据四参数方程绘制SCCA1/SCCA2浓度与492 nm吸光度的关系图。

注意事项

在实验过程中，确保所有试剂和设备的清洁，以避免交叉污染。同时，建议在每次实验前进行标准曲线的建立，以确保结果的准确性。