背景介绍
趋化性是细胞在化学因子引导下定向迁移的能力，是免疫反应、发育和肿瘤转移等生物学过程中的关键机制。本实验采用微化学趋化室，研究白细胞或其他迁移细胞对趋化因子的响应，为理解细胞迁移提供重要工具。
实验原理
该方法利用两个多孔室隔开，底部加入含有趋化因子的溶液，上部加入细胞悬液。细胞通过孔洞穿过滤膜，向趋化因子源迁移。迁移细胞在滤膜背面被固定、染色后计数，计算迁移指数，反映细胞对趋化因子的响应强度。
操作步骤
一、滤膜准备
- 使用25×80毫米的聚碳酸酯滤膜（孔径3、5、8或10微米），避免使用含有聚乙烯丙烯（PVP）的材料。将胶原蛋白溶液浸泡滤膜，孵育2小时于37°C，确保滤膜表面覆盖胶原蛋白以促进细胞粘附（特别适用于粘附性细胞如HEK-293）。
二、细胞准备
- 培养细胞至80%融合，或使用悬浮细胞。用胰酶-EDTA溶液消化细胞，加入细胞分离缓冲液，离心收集细胞，调整细胞浓度至每毫升0.5至1百万个细胞，保持在37°C备用。
三、趋化因子溶液制备
- 将趋化因子（如化学趋化因子或其他诱导迁移的物质）稀释到所需浓度（通常0.01至100纳摩尔），同时准备阴性对照（仅含缓冲液）。在真空下去除气泡，确保溶液均匀，预热至37°C。
四、实验装置组装
- 使用多孔微化学趋化室（如Neuro Probe的AP48型号），用水冲洗干净并用压缩空气吹干。将含有趋化因子的溶液加入底部孔中，确保无气泡，滤膜放置于孔上方，滤膜的光亮面朝上，轻轻放置，避免移动。盖上密封垫和上盖，固定好。
- 在上室加入悬浮细胞（50微升，浓度为每毫升0.5-1百万细胞），避免气泡，放置于37°C、5% CO₂培养箱中孵育30分钟至3小时（根据细胞类型调整）。
五、迁移细胞的固定与染色
- 拆卸装置，将滤膜从密封垫上取下，用缓冲液冲洗去除非迁移细胞。使用Diff-Quick染色试剂对滤膜进行染色，固定4分钟后依次用染色液冲洗，最后在载玻片上晾干。
六、细胞计数与分析
- 在显微镜下以200倍放大观察染色细胞，计数3至5个视野中的细胞数。计算迁移指数，即迁移到趋化因子组的细胞数除以对照组的细胞数，反映细胞的趋化响应强度。
注意事项与技巧
- 胶原蛋白应存放在酸性条件下，避免中性pH导致不溶。不同细胞类型对滤膜孔径有不同需求，例如中性粒细胞建议使用5微米孔径。操作中避免用手直接接触滤膜，确保无气泡和干燥。趋化因子的浓度应根据文献或预实验优化，孵育时间也应根据细胞类型调整。使用对照和变异分析区分趋化性与非定向迁移（化学运动性）。