简介
TransWell趋化性实验是一种用于研究白细胞（如中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞）或其他迁移细胞对化学趋化因子（如趋化因子或其他化学信号分子）引导迁移的体外实验方法。该方法通过在上室加入细胞悬液，下室加入含有趋化因子的培养基，中间由具有特定孔径的滤膜隔开，观察细胞沿浓度梯度迁移的情况。该技术广泛应用于免疫学、炎症反应和细胞迁移机制的研究中。
实验流程
- 提前一天配制C缓冲液（C-Buffer），在培养箱中静置过夜以达到平衡状态。
- 将原始24孔板中的6.5毫米Transwell滤膜插入，存放于另一空白的24孔板中备用。
- 在原始板的孔底涂覆Sigmacote防粘剂，待其完全干燥后使用。
- 用C缓冲液稀释所需的趋化因子（如化学趋化因子或其他引导迁移的分子），每孔加入600微升，放入培养箱中平衡。
- 制备待检测细胞悬液，进行细胞计数，并用37°C平衡的C缓冲液重悬，浓度为每100微升1×10^6个细胞。
- 将步骤2中准备的Transwell滤膜插回含有趋化因子的孔中，加入100微升细胞悬液，放回培养箱中孵育预定时间（如30分钟至数小时，视细胞类型而定）。
- 孵育结束后，将滤膜取出，用显微镜观察细胞是否已迁移到下室。若检测单一细胞类型，可直接计数；若为混合细胞群，需染色后用流式细胞仪分析。
- 为释放粘附在滤膜底部的细胞，加入50微升70 mM EDTA，等待5分钟后观察细胞是否脱离。
- 用镊子取出滤膜，将其轻轻敲击以去除残留液体，然后加入10,000个微珠（如Bangs Laboratories的15微米Dynospheres），确保体积不少于50微升，混匀后加入到每个孔中。
- 用吸管充分混匀每个孔的内容物，将样品转移到FACS管中进行染色或直接分析。利用流式细胞仪检测迁移细胞数目，计算迁移细胞比例或迁移指数。
数据分析
迁移指数（Migration Index）为迁移细胞数与随机迁移（只加入缓冲液）细胞数的比值。也可用迁移的细胞占起始细胞总数的百分比表示，例如：若上室加入1×10^6细胞，迁移到下室的细胞为1×10^5，则迁移率为10%。
缓冲液配制
- HBSS缓冲液：含0.4 mM磷酸钾、0.6 mM硫酸镁、5.4 mM氯化钾、1.3 mM氯化钙，过滤灭菌，pH调至7.4，存储于4°C。
- Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）：由供应商购买，使用前配制。
- 70 mM EDTA：在HBSS中配制，用于细胞脱粘。
- 标记缓冲液：含1%无内毒素牛血清白蛋白（BSA）、10 mM HEPES（pH 6.9）、无碳酸氢钠的DMEM粉末。
- C缓冲液：由50%标记缓冲液和50%DMEM组成，使用前调节pH至6.9，过夜平衡。
注意事项与技巧
- 滤膜孔径应根据细胞类型选择：中性粒细胞和单核细胞用3微米孔径，淋巴细胞用3-5微米，成纤维细胞用8微米。
- Sigmacote涂层应充分干燥，确保非粘附性。
- 趋化因子的浓度范围一般为0.01 nM至100 nM，具体应参考文献优化。
- 细胞悬液应在使用前立即制备，浓度调整准确以确保实验重复性。
- 孵育时间根据细胞类型不同而变化，建议中性粒细胞约30分钟，淋巴细胞和单核细胞为3-4小时。
- 加入微珠时，确保浓度为每50微升中含10,000个微珠，混匀后加入，避免体积过少。