描述
电泳迁移率变化实验（EMSA）用于检测核内NF-kB。
实验步骤
核提取物
为了制备核提取物，细胞在含有NP-40的蔗糖缓冲液中轻柔裂解，同时保持细胞核完整。经过洗涤步骤后，细胞核在低盐缓冲液中悬浮，使细胞核膨胀。然后缓慢加入高盐缓冲液：核质被提取到缓冲液中，而核包膜保持完整并保留基因组DNA。通过离心将提取物与核包膜/DNA分离。
EMSA
在EMSA中，核提取物与含有NF-kB特异性识别序列的放射性标记寡核苷酸探针孵育。结合反应在特定的盐/pH条件下进行。加入聚dIdC以防止蛋白质与NF-kB寡核苷酸探针的非特异性结合，从而减少背景。结合后，样品在非变性PAGE凝胶上分离，带状信号通过放射自显影法检测。如果核提取物中存在NF-kB亚基，则其与探针的相互作用会使标记探针的带位上移，因为探针与NF-kB亚基的复合物具有比单独探针更低的电泳迁移率。移位带的强度是核分馏中NF-kB含量的量度（因为探针是以高浓度添加的）。为了检查观察到的移位带是否特异于NF-kB，进行竞争实验：对显示强烈移位带的蛋白提取物，额外加入非标记（“冷”）寡核苷酸以过量形式。如果观察到的信号是NF-kB特异性的，那么在冷NF-kB野生型竞争者存在的情况下，这些信号应该消失，而在冷“突变”竞争者存在的情况下则不受影响。
超移位
为了确定哪些NF-kB亚基负责观察到的移位带，可以通过向结合反应中添加不同的NF-kB亚基特异性抗体来“超移位”EMSA信号。抗体会结合到相应的NF-kB亚基，从而形成NF-kB/探针/抗体三元复合物：该复合物的电泳迁移率甚至低于NF-kB/探针复合物，因此可以观察到超移位带。有时，即使其对应的NF-kB亚基存在，抗体也不会导致移位带的出现：相反，通过结合其NF-kB亚基，抗体会阻止NF-kB亚基与标记探针的结合，从而导致主要移位信号的强度降低。
核提取物的制备
收获细胞并重悬于1毫升PBS中。将细胞转移到1.5毫升微量离心管中，以500xg（在Eppendorf微量离心机中2500 rpm）离心5分钟，4°C。吸去PBS，并在每1000万细胞中重悬于100微升蔗糖缓冲液中。轻轻上下移液混匀。以500g在4°C下离心5分钟。吸去上清液，或如果需要细胞质部分，则将其转移到新管中。用1毫升蔗糖缓冲液（不含NP-40）洗涤核沉淀。轻轻上下移液混匀。以500g在4°C下离心5分钟。吸去所有洗涤缓冲液。以适当体积的低盐缓冲液（例如每1000万细胞30微升）重悬细胞，确保所有液体保持在管底。缓慢加入等体积的高盐缓冲液（可能分小份加入），同时用移液器尖端混匀。将样品在4°C的摇床或旋转器上孵育30-45分钟。以14000g离心15分钟（4°C）。将上清液（=核提取物）转移到新管中。定量提取物中的蛋白质含量，并将核提取物储存于-70°C。提取物准备好用于EMSA实验。
EMSA实验
A. 寡核苷酸探针的标记：T4多核苷酸激酶反应
对于NF-kB特异性探针，首先分别标记正义和反义寡核苷酸，然后在退火之前纯化寡核苷酸以获得5'和3'标记的双链DNA探针。以下是正义和反义寡核苷酸的野生型序列（NF-kB结合位点序列下划线）：
NFkB wt（正义）：AgT TgA ggg gAC TTT CC Cag gC
NFkB wt（反义）：gCC Tgg gAA AgT CCC CTC AAC T
对于制备标记探针，按照以下协议在总量20微升中标记正义和反义寡核苷酸：
0.5微升寡核苷酸（200 ng/微升）
2微升10x PNK反应缓冲液
0.5微升T4多核苷酸激酶
1.5微升γ-32P-ATP（如果是旧批次则取3微升）
x微升ddH2O。
在37°C孵育1小时。γ-32P-ATP浓度为10 mCi/ml = 370 MBq/ml，3000 Ci/mmol（对应3.3 M ATP含量）。
标记后，使用QIAquick核苷酸去除试剂盒（Quiagen）纯化标记的寡核苷酸。用100微升10 mM Tris，pH8.0从柱中洗脱纯化的正义和反义寡核苷酸（均为100微升），并在室温下孵育10分钟以进行退火。探针现在可以使用。
B. 结合反应：
在冰上操作，除了最后在室温下孵育！结合反应的总量通常为10微升，但如果提取物稀释，可以增加到20微升。在设置结合反应时，按以下顺序添加组分。
管1应仅包含标记探针和染料（BPB/XC），例如：6微升ddH2O + 2微升结合缓冲液 + 1微升染料 + 1微升标记探针。
管2至N包含感兴趣的提取物和标记探针，如下所示（记住：通常总量=10微升）：
x微升ddH2O
1微升聚dIdC（1 g/微升在TE中）
2微升结合缓冲液（5X）
x微升核提取物（5 g蛋白质）
1微升标记探针（激酶反应的1:15稀释）
添加所有组分后，简要离心反应管以将所有液体带到底部。室温孵育30分钟。然后将所有样品加载到非变性5% PA凝胶中（见下文）。
对于竞争测试，在添加标记探针之前，向结合反应混合物中添加1微升“冷”竞争探针（20 ng/微升库存）。调整水的量以保持总量为10微升。
野生型竞争探针的序列与标记的NF-kB特异性探针相同，而“突变”探针在识别区域内有核苷酸交换（NFkB结合位点下划线的突变位点加粗）：
NFkB mutant（正义）：AgT TgA ggC gAC TTT CCC Agg C
NFkB mutant（反义）：gCC Tgg gAA AgT CgC CTC AAC T
如果进行超移位，在添加标记探针之前，向结合反应混合物中添加1微升1 g/微升的抗体（特异性针对p50、p52、p65 = RelA、RelB或cRel亚基）。
C. PAGE：
准备5%非变性PA（0.5 x TBE）凝胶以运行EMSA样品。凝胶的尺寸例如为20x17厘米。使用1.5毫米的间隔和约15个孔的梳子。
对于50毫升5% PA凝胶：
8.3毫升30% PA溶液（29:1）
2.5毫升10x TBE
39.2毫升ddH2O
50微升TEMED
0.5毫升APS（10%）
将EMSA样品加载到凝胶的孔中。在0.5x TBE中以1 mA/cm的速度运行凝胶2.5小时（开始时电压约为120 V，随着电泳的进行电压增加到> 200 V）。PAGE后，将凝胶转移到双层Whatman纸上，并在75°C的凝胶干燥机中干燥45-60分钟。将干燥的凝胶暴露于放射自显影胶卷（在-70°C下与增强膜一起）。
配方
蔗糖缓冲液
成分：50毫升的配方：
0.32 M蔗糖
10 mM Tris HCl pH 8.0
3 mM CaCl2
2 mM MgOAc
0.1 mM EDTA
0.5% NP-40
1 mM DTT
0.5 mM PMSF
5.47克蔗糖
0.5毫升1 M Tris HCl，pH 8.0
150微升1 M CaCl2
100微升1 M MgOAc
10微升0.5 M EDTA（pH 8.0）
2.5毫升10% NP-40
42.4毫升水
在使用前新鲜加入DTT和PMSF。
低盐缓冲液
成分：50毫升的配方：
20 mM HEPES（pH 7.9）
1.5 mM MgCl2
20 mM KCl
0.2 mM EDTA
25%甘油（v/v）
0.5 mM DTT
0.5 mM PMSF
10毫升100 mM HEPES（pH 7.9）
75微升1M MgCl2
0.4毫升2.5 M KCl
20微升0.5 M EDTA（pH 8.0）
15.75克甘油
27毫升水
在使用前新鲜加入DTT和PMSF。
高盐缓冲液
成分：50毫升的配方：
20 mM HEPES（pH 7.9）
1.5 mM MgCl2
800 mM KCl
0.2 mM EDTA
25%甘油（v/v）
1% NP-40
0.5 mM DTT
0.5 mM PMSF
4.0 g/ml氨基酸酶，抑制剂
10毫升100 mM HEPES（pH 7.9）
75微升1M MgCl2
16毫升2.5 M KCl
20微升0.5 M EDTA（pH 8.0）
15.75克甘油
5毫升10% NP-40
6.4毫升水
在使用前新鲜加入DTT、PMSF和蛋白酶抑制剂。
5X结合缓冲液
成分：10毫升的配方：
50 mM Tris HCl（pH 8.0）
750 mM KCl
2.5 mM EDTA
0.5% Triton-X 100
62.5%甘油（v/v）
1 mM DTT
0.5毫升1 M Tris HCl（pH 8.0）
3毫升2.5 M KCl
50微升0.5 M EDTA（pH 8.0）
50微升Triton-X 100
7.87克甘油
在使用前新鲜加入DTT。