背景介绍

拟南芥叶肉原生质体瞬时表达实验是一项常用于植物分子生物学研究的技术，能够快速检测基因表达、信号转导及蛋白定位等功能。该方法通过酶解叶片获得原生质体，并进行转染操作，广泛应用于基因功能分析、调控机制研究及细胞器分离。

实验材料

实验所需植物包括在B5培养基上生长的BE株系、温室培养的BE、Col、Ler和C24株系。建议选用3-4周龄、未开花的叶片（第二至第四对叶片，1-2厘米），对于Col和Ler株系，推荐较短光照周期（12-13小时）以延缓开花。

原生质体分离流程

1. 用新鲜刀片将叶片切成0.5-1毫米宽的条状，避免损伤组织。此步骤需一定练习以保证效率和产量。

2. 将叶片条置于含酶溶液的125毫升烧瓶（10毫升酶溶液），可采用真空渗透5-30分钟，或直接放入培养皿加酶溶液后置于真空干燥器。

3. 确保叶片完全浸没于酶溶液中，继续消化60-90分钟并轻微摇动（40 rpm），或在黑暗中静置3-12小时（根据实验目的调整）。过长的黑暗消化（16-18小时）可能影响细胞生理反应，但对去分化和再生有一定作用。

4. 消化后酶溶液变绿色，表明原生质体释放。轻摇80 rpm 1分钟释放原生质体，注意操作温和。

5. 用35-75微米尼龙网过滤酶溶液，100 x g离心1-2分钟收集原生质体。若回收率低，可提高离心速度或加入50 mM CaCl2。原生质体易于重悬。

6. 用冷洗涤/孵育液（WI）或W5溶液洗涤原生质体，重悬于同一溶液（2 x 10⁵/ml），冰浴30分钟。部分实验可室温保存，但建议新鲜原生质体用于基因表达、信号转导及蛋白定位研究。

7. 若采用W5溶液，离心后重悬于MMg溶液（2 x 10⁵/ml）进行PEG转染。

溶液配方

酶溶液：1-1.5%纤维素酶R10，0.2-0.4%果胶酶R10，0.4 M甘露醇，20 mM KCl，20 mM MES（pH 5.7），55℃加热10分钟后冷却，加入10 mM CaCl2，5 mM β-巯基乙醇（可选），0.1% BSA。溶液呈浅棕色且澄清（0.45微米过滤）。

PEG溶液（40%，v/v）：4 g PEG4000，3 ml水，2.5 ml 0.8 M甘露醇，1 ml 1M Ca(NO₃)₂或CaCl₂。

WI洗涤/孵育液：0.5 M甘露醇，4 mM MES（pH 5.7），20 mM KCl。

W5溶液：154 mM NaCl，125 mM CaCl₂，5 mM KCl，2 mM MES（pH 5.7），无葡萄糖。

MMg溶液：0.4 M甘露醇，15 mM MgCl₂，4 mM MES（pH 5.7）。

应用与注意事项

该原生质体体系适用于研究叶细胞对糖、激素（如生长素、脱落酸、细胞分裂素）、热、乙醇、过氧化氢、钙及诱导因子的反应，其反应与完整叶片相似。原生质体亦可用于分离细胞核和叶绿体。建议根据实验目的调整原生质体数量和DNA比例。

参考文献

无