背景与意义

拟南芥叶肉原生质体瞬时表达体系是一种高效的植物分子生物学实验方法，广泛用于研究基因调控、信号转导和细胞死亡等过程。该体系通过PEG介导转染或电转法，将外源DNA导入原生质体，实现短时间内的基因表达分析。相比于稳定转化，瞬时表达能快速获得实验结果，特别适用于早期信号事件和功能验证。

实验步骤

所有操作在23℃进行。首先，加入20 ml（20-40 μg，5 kb质粒）DNA于微量离心管中，加入200 ml原生质体（约4×10⁴个），充分混合。再加入220 ml PEG/Ca溶液，混匀（每次处理6个样品）。在23℃孵育5-30分钟后，用0.8 ml W5溶液稀释并混合。以临床离心机3档离心1分钟，去除PEG。轻柔重悬原生质体，稀释于100 ml WI或W5溶液，加入至6孔板中（1 ml WI或W5）。此流程可根据实验需求缩放。

由于实验为瞬时表达，无需严格无菌操作。如需抑制细菌生长，可加入50 mg/ml氨苄青霉素。该体系适用于信号转导、基因调控及细胞死亡等早期事件研究（参考文献见文末）。无需载体DNA。建议使用6孔培养板（Falcon 3046），大规模实验可用12孔或24孔板（50-200样品）。培养板可用5%小牛血清预涂1秒以防原生质体粘附。原生质体孵育时间为RNA分析2-6小时，酶活分析及蛋白标记2-12小时。报告酶分析需100-10³个原生质体，蛋白标记/免疫沉淀/Western blot需10⁴-10⁵个，RNA分析需10⁶个。

原生质体可用适当培养基和植物激素进行细胞壁再生和细胞周期启动（Damm et al., 1989；Masson & Paszkowski, 1992）。PEG转染效率以GFP表达为指标可达50-90%，健康原生质体大多保持完整。电转效率为10-30%，但可能导致超过50%原生质体死亡，条件可优化。不同植物种类、组织或生长状态对电转反应不同，如玉米叶肉原生质体耐受性较高（Sheen, 1991）。

收获原生质体：以100×g离心2分钟，弃上清。样品可冷冻保存于-80℃。裂解原生质体：加入100 ml低渗缓冲液（10 mM Tris, pH 8，2 mM MgCl₂）或LUC裂解液（含1% Triton X-100），剧烈涡旋2秒。CAT酶分析可用经济快速的二甲苯萃取法（Seed and Sheen, 1988；Sheen, 1999）。加热细胞提取液于65℃、5 mM EDTA可去除CAT活性抑制剂。LUC分析用Promega试剂盒和荧光仪。GUS分析按Jefferson方法：将细胞提取液加入100 μl 1 mM MUG，37℃孵育30-90分钟，加入0.9 ml 0.2 M Na₂CO₃终止反应，测定MU荧光。

配方

酶液：1-1.5%纤维素酶R10（RS过强），0.2-0.4%果胶酶R10（Yakult Honsha），0.4 M甘露醇，20 mM KCl，20 mM MES（pH 5.7）。酶液于55℃加热10分钟（灭活蛋白酶、增强溶解性），冷却后加入10 mM CaCl₂，5 mM β-巯基乙醇（可选），0.1% BSA。酶液呈浅棕色透明（0.45 μm过滤）。

PEG溶液（40%，v/v）：4 g PEG4000，3 ml水，2.5 ml 0.8 M甘露醇，1 ml 1M Ca(NO₃)₂或CaCl₂。

WI溶液：0.5 M甘露醇，4 mM MES（pH 5.7），20 mM KCl。

W5溶液：154 mM NaCl，125 mM CaCl₂，5 mM KCl，2 mM MES（pH 5.7）（不含葡萄糖）。

MMg溶液：0.4 M甘露醇，15 mM MgCl₂，4 mM MES（pH 5.7）。

电转操作

40 μg质粒DNA，4-6×10⁴原生质体/300 ml 0.3 M甘露醇/4 mM MES（pH 5.7）/150 mM KCl，300-400 V/cm，5 ms，200 μF，1-2次脉冲。

参考文献

Asai et al., Plant Cell 12:1823-1835, 2000.
Damm et al., 1989, MGG 217: 6-12.
Masson & Paszkowski, 1992, Plant J. 2: 829-833.
Sheen, Plant Cell, 3:225-245, 1991.
Seed and Sheen, 1988, Gene 67, 271-277.
Sheen, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel eds, supplement 9.6.5.
Jefferson, GUS assay方法。