描述：本协议提供了修改后的免疫荧光（IIF）步骤，以保持GFP荧光。

步骤：

1. 将细胞培养至OD 0.5。

2. 收获0.5-1 ml细胞，重悬于PBS中，加入PFA至最终浓度4%。若使用常规甲醛，直接加入培养基中至10%体积。室温孵育。对于HA免疫荧光，使用PFA固定不超过20分钟。对于纺锤体免疫荧光，更长的固定时间（1-2小时）效果更好。对于GFP，固定15-60分钟，避免与甲醇接触。

3. 固定后，用1 ml 0.1 M KPO4 pH 6.5洗涤两次，再用0.1 M KPO4，1.2 M山梨醇（Phos/Sorb）洗涤两次（10K转速离心1分钟）。重悬于1 ml Phos/Sorb中。细胞可以在此阶段过夜储存。如有需要，进行超声处理。

4. 取0.5 ml细胞进行球化处理，其余细胞在4°C储存。将1 L bME和10 L oxalyticase（1 mg/mL储备液）加入0.5 ml细胞中。在23°C孵育约20-30分钟。

5. 在细胞球化的同时，准备多聚赖氨酸涂层载玻片：在每个载玻片的孔中加入10 μl多聚赖氨酸溶液（0.1% ddH2O）。室温孵育约1分钟。去除多聚赖氨酸，加入约20 μl ddH2O到每个孔中。重复洗涤并风干。

6. 通过3K转速离心3-5分钟收集球化细胞。用Phos/Sorb洗涤两次。对于Triton渗透，进入步骤7；对于甲醇/丙酮处理，进入步骤8。

7. Triton处理：将细胞重悬于180 μl Phos/Sorb中，加入20 μl 10% Triton。室温孵育1-2分钟，然后轻轻离心，用Phos/Sorb洗涤两次。将细胞重悬于200-500 μl Phos/Sorb中，将10-20 μl细胞置于多聚赖氨酸涂层载玻片上。室温孵育20分钟，然后用PBS/BSA（1X PBS，1% BSA）洗涤两次。

8. 甲醇/丙酮处理：将20 μl细胞置于每个多聚赖氨酸涂层孔中。让细胞沉淀10-20分钟。吸出上清液，立即（但要轻柔）将载玻片浸入-20°C甲醇中6分钟。然后转移到-20°C丙酮中30秒。让载玻片风干1-2分钟。在每个孔中加入20 μl PBS/BSA。将载玻片放入湿润室中至少5分钟。

9. 在加入一抗之前吸出PBS/BSA。将一抗用PBS-BSA稀释，并在每个孔中加入15 μl。室温孵育1小时或4°C过夜。

10. 用PBS/BSA洗涤孔5次。加入二抗。如果二抗是抗山羊的，在PBS中进行抗体反应。室温（避光）孵育2小时。

11. 用PBS/BSA洗涤孔5次。

12. 吸出最后一次洗涤液。在每个孔中加入一滴含有DAPI的封片介质。盖上盖玻片，避免气泡，并用指甲油密封。如果观察GFP，不要使用指甲油。将载玻片储存在-20°C。

抗体稀释度：

一抗：

小鼠抗微管蛋白（Sigma）1:500

小鼠抗HA（12CA5和16B12）1:250

兔抗Pds1（用于过表达样本）1:10,000