酵母间接免疫荧光实验步骤

实验步骤

1. 将1mL酵母细胞（约0.2-0.5 OD）与0.1mL 36%甲醛混合，室温下固定60分钟。

2. 用1mL蒸馏水洗涤细胞两次（10,000转/分钟离心5秒）。然后用1mL SK缓冲液洗涤细胞，并重悬于450μL SK缓冲液中。超声处理5秒（最低档）。

3. 加入50μL新鲜制备的10倍浓缩的消化液，室温下孵育10-15分钟。使用显微镜观察细胞，当细胞不再是暗的但有微弱的晕影时，表示消化适度。

4. 将细胞轻轻吸取，加入到涂有聚赖氨酸的玻片上，室温下孵育5分钟。吸去液体。（可选：用10μL蒸馏水洗涤）。

5. 将玻片放入-20℃的甲醇中处理6分钟，然后放入-20℃的丙酮中处理30秒。取出玻片，晾干。（可保存于4℃）。

6. 在每个样品孔中加入15μL 10% BSA（牛血清白蛋白）PBS溶液，室温下孵育20分钟（保湿盒中）。吸去液体。

7. 加入15μL 1/200稀释的YOL1/34（大鼠抗微管蛋白抗体）于10% BSA/PBS中，室温下孵育60分钟。

8. 吸去液体（勿使干燥），用15μL PBS洗涤5次。

9. 加入15μL 1/200稀释的山羊抗大鼠-FITC（荧光标记抗体）于PBS中，室温下避光孵育60分钟（保湿盒中）。

10. 吸去液体，用15μL PBS洗涤5次。

11. 加入5μL DAPI（核染色剂）和抗荧光淬灭封片介质。

试剂配方

SK缓冲液：

7.5 mL 2M山梨醇（25℃）

651μL 1M K₂HPO₄（pH 7.5，50mM）

100.5μL 1M KH₂PO₄（pH 7.5）

6.75μL H₂O

定容至15mL或50mL

10倍浓缩消化缓冲液：

488μL H₂O

0.5μL β-巯基乙醇

8.5μL 酶解液（zymolyase）