本协议允许使用荧光显微镜观察稳定粘附细胞系表达的带有表位标签的受体。与渗透细胞协议不同，该协议通过将抗体“喂给”活的未渗透细胞，仅可视化最初位于细胞表面的受体。

操作步骤：

1. 使用6孔组织培养板，向每个待用孔中添加2mL培养基。

2. 将培养基放入孵育器中平衡约30-45分钟。

3. 添加盖玻片，并在孵育器中平衡约25分钟。

4. 将一抗以1:500至1:1000的稀释比例添加到培养基中，孵育30分钟。示例抗体包括M1鼠抗Flag抗体（Sigma，Covance）（Ca²⁺敏感），稀释比例为1:350-1:500；12CA5鼠抗HA（Roche），稀释比例为1:1000的多克隆抗体。

5. 处理细胞。典型的孵育时间约为25分钟。

6. 快速吸出培养基并添加固定剂（约2 mL/孔），固定15-20分钟。

7. 洗涤3次。

8. 吸出最后一次洗涤液，仔细擦干盖玻片边缘。仅在盖玻片上添加约50 μL的Blotto，孵育20分钟。变通方法：有些人喜欢将盖玻片转移到组织培养皿中的石蜡膜上，石蜡膜上滴有少量抗体溶液，皿内放有湿润的Whatman滤纸。石蜡膜有助于抗体溶液在盖玻片上“聚集成珠”，湿润的Whatman滤纸有助于防止抗体干燥。

9. 吸出Blotto，添加二抗。在暗处孵育20分钟。用Blotto稀释抗体。Cy3驴抗鼠（Jackson Immunoresearch）1:500，FITC山羊抗鼠1:500，TexasRed山羊抗鼠1:500。

10. 洗涤3次。

11. 使用抗褪色溶液（如VectaShield（Vector Labs）或Citifluor（Ted Pella））进行湿装。将一小滴封片介质滴在载玻片上。用镊子夹起盖玻片，吸去多余液体。将盖玻片细胞面朝下载玻片上。吸去盖玻片边缘多余的封片介质。用指甲油密封边缘。

配方：

洗涤液 -- 总体积2升；Maniatus TBS（含1mM CaCl₂），16g NaCl，6g Tris碱，0.4g KCl，0.294g CaCl₂·2H₂O；用浓HCl调pH至7.4。

Blotto -- 总体积10mL，0.3g脱脂奶粉（3%），100μL 10% Triton X-100（0.1%），100μL 100mM CaCl₂（1mM），500μL 1M Tris-Cl pH 7.5（50mM）。

固定剂 -- 每张盖玻片约2mL，37%甲醛用PBS（150mM NaCl，10mM NaPi，pH 7.4）1:10稀释。