抗体偶联是将荧光标记物（如FITC）或生物素（Biotin）连接到抗体（如IgG）上的重要实验技术，广泛应用于流式细胞术、免疫荧光检测等领域。以下是将FITC或Biotin标记到IgG的详细实验步骤。
实验步骤
1. 将2mg IgG溶解在1mL PBS（pH 8.0）中，使用干净的16x125mm聚丙烯试管。如有需要，使用0.5M碳酸盐缓冲液调整pH至8.0。
2. 新鲜配制1mg/mL的NHS-FITC（溶于DMSO）或1mg/mL NHS-LC-Biotin（溶于水）。若进行FITC标记，在涡旋混匀状态下向抗体溶液中加入75μL FITC/DMSO溶液；若进行生物素标记，则加入150μL Biotin/水溶液。
3. 室温孵育45分钟。
4. 分离偶联后的抗体与未偶联的FITC或Biotin。可采用透析法或PD-10柱层析法。透析法：PBS透析24小时，期间更换3次PBS，适用于初始浓度小于1mg/mL的抗体。PD-10柱层析法：会将抗体稀释2倍。
使用PD-10柱的具体步骤：
a) 用30mL PBS预洗PD-10柱。
b) 当柱顶部液体几乎流干时，加入1mL FITC-IgG或Biotin-IgG溶液，待其进入柱子后关闭开关。
c) 在柱顶部加入5mL PBS。
d) 打开开关，收集2mL洗脱液，弃去前2mL，保留第2个2mL部分，即为偶联后的抗体。
5. FITC标记后，可计算FITC与蛋白质的比例（F/P比）。生物素标记后，可通过流式细胞术检测抗体活性。
F/P比计算方法
a) 将FITC-IgG复合物稀释至280nm吸光度（A280）小于2.0。
b) 测定并记录A280和A492。
c) 计算蛋白质浓度：蛋白质 (mg/mL) = (A280 - (A492 × 0.35)) / 1.4
d) 计算蛋白质摩尔数：= 蛋白质 (mg/mL) / 1.5 × 10^5
e) 计算FITC摩尔数：= A492 / 0.69 × 10^5
f) 计算F/P比：= FITC摩尔数 / 蛋白质摩尔数
g) 流式细胞术适用的F/P比通常在5:1至6:1之间。