抗体偶联实验步骤

描述

以下协议可用于将FITC或生物素偶联到IgG抗体上。两者使用相同的方法，若有差异，将在后文中说明。

实验步骤

1. 在干净的16x125mm聚丙烯试管中，将2mg的IgG溶解在1mL的PBS（pH 8.0）中。如有需要，使用0.5M碳酸盐缓冲液调整pH至8.0。
2. 准备新鲜的1mg/mL的NHS-FITC（在DMSO中）或1mg/mL的NHS-LC-Biotin（在去离子水中）。若进行FITC偶联，边搅拌边向抗体中加入75μL的FITC/DMSO溶液；若进行生物素化，边搅拌边向抗体中加入150μL的生物素/水溶液。
3. 在室温下孵育45分钟。
4. 接下来的步骤是将偶联的FITC或生物素与未偶联的分开。这可以通过两种方法完成。第一种是将偶联抗体在PBS中透析24小时，并更换3次PBS（推荐用于浓度低于1mg/mL的抗体）。第二种方法是使用PD-10柱，此方法会将抗体稀释2倍。
5. 使用PD-10柱的步骤：
   1. 用30mL的PBS清洗PD-10柱。
   2. 在柱子顶部几乎干燥时，加入1mL的FITC-Ig或生物素Ig溶液。抗体在流出柱子后关闭止水阀以停止流动。
   3. 在顶部加入5mL的PBS。
   4. 打开止水阀，收集2mL的分馏液，丢弃前2mL，保留第二个2mL的分馏液。第二个2mL的分馏液中含有偶联的抗体。
   注意：如果加入了2mL的偶联Ig，则丢弃前1mL，保留接下来的4mL。抗体在离开柱子后总是会稀释2倍。
6. 在进行FITC偶联时，可以确定FITC与蛋白质的比率。在进行生物素化时，可以通过流式细胞术测试抗体。
7. F/P比率：
   1. 用缓冲液稀释FITC-Ig复合物的一个样本，使得280nm处的吸光度（A280）小于2.0。
   2. 测定并记录A280和A492。
   3. 计算蛋白质浓度：蛋白质（mg/mL）= (A280 - (A492 x 0.35))/1.4。
   4. 计算蛋白质的摩尔数：= 蛋白质（mg/mL）/1.5x10^5。
   5. 计算FITC的摩尔数：= A492/0.69x10^5。
   6. 确定F/P比率：= FITC的摩尔数/蛋白质的摩尔数。
   7. F/P比率应在5:1到6:1之间，以便用于流式细胞术。

配方

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材料

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提示

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