摘要：本文详细介绍了一种利用Bst DNA聚合酶催化的放射性标记两步法单链DNA测序技术。该方法通过放射性标记的核苷酸延伸反应，实现对单链DNA的高灵敏度测序，适用于分子生物学研究中的DNA序列分析。

实验步骤：

1. 在微量离心管中配制延伸反应混合物，组分包括：750 ng M13模板DNA，2 μl Bst反应缓冲液，2 μl Bst核苷酸延伸混合物，1 μl引物（浓度2.5 ng/μl），0.5-1 μl放射性标记核苷酸（[α-32P]-dATP或[α-35S]-dATP），1 μl稀释后的Bst聚合酶（0.1 U/μl），用无菌双蒸水补足至12 μl。

2. 将反应体系在67℃孵育2分钟，随后短暂离心以收集冷凝液。

3. 取2.5 μl反应液分别加入预先分装于V底微孔板中的四种碱基特异性终止混合物中。

4. 在67℃继续孵育10分钟，孵育结束后短暂离心，反应可在-70℃保存。

5. 通过加入4 μl琼脂糖凝胶加载染料终止反应，并在100℃加热5-7分钟。

实验材料：放射性标记核苷酸[α-32P]-dATP和[α-35S]-dATP购自Amersham，Bst聚合酶购自BioRad（货号170-3406），使用Bst稀释缓冲液进行酶的稀释。

技术背景： Bst DNA聚合酶具有较高的温度稳定性和强大的延伸能力，适合用于单链DNA的放射性标记测序。该方法通过放射性核苷酸的掺入，实现对DNA序列的灵敏检测，广泛应用于基因组学和分子遗传学研究。

该技术虽较早期，但其高灵敏度和特异性仍为部分特殊测序需求提供了有效手段。随着高通量测序技术的发展，放射性标记测序逐渐被替代，但在某些实验条件下仍有其独特价值。