描述

噬菌体展示是一种便捷的方法，用于筛选与目标分子结合的多肽。以下方案旨在减少或消除“背景”噬菌体（即结合固体支持物或其他非特异性靶标的展示肽噬菌体）的分离。

流程

A. 第一轮噬菌体筛选

所有步骤在室温下进行。

1. 向ELISA板的每个孔中加入200 μl His6标签的诱饵蛋白（约10 μg蛋白）。

2. 用封口膜密封板以防蒸发，室温孵育2小时。

3. 吸去每个ELISA孔中的溶液。

4. 每孔加入200 μl 1% BSA溶液进行封闭。

5. 重新密封板，室温孵育2小时。

6. 吸去每个ELISA孔中的溶液。

7. 加入500 μl PBS/Tween溶液，然后吸去。

8. 重复步骤A6三次（共四次洗涤）。

9. 加入约1×10^10个噬菌体（溶于PBS/Tween溶液，见提示1）。

10. 用封口膜密封板，室温孵育2小时。

11. 吸去每个ELISA孔中的溶液。

12. 用PBS/Tween溶液洗涤每个ELISA孔八次（步骤A7至A8）。

13. 每孔加入100 μl 50 mM甘氨酸（pH 2.0），孵育15分钟。

14. 将甘氨酸溶液转移至500 μl微量离心管中。

15. 加入25 μl 1 M Tris中和溶液。

16. 将收集的上清液加入适量细胞（如K91细胞）以扩增筛选的噬菌体（见提示1）。

17. 收集所得噬菌体颗粒，继续B部分。

B. 第二轮噬菌体筛选

1. 向1.5 ml微量离心管中加入20 μl Ni-NTA磁珠。

2. 向微量离心管中加入100 μl His6标签的诱饵蛋白（约10 μg蛋白）（见提示2）。

3. 在4℃旋转混合器上孵育1小时。

4. 在微量离心机中以2000 rpm离心1分钟，沉淀Ni-NTA磁珠，吸去上清液。

5. 加入1 ml预冷的50 mM Na2HPO4（pH 8.0）缓冲液，轻轻混匀。

6. 吸去上清液。

7. 再洗涤Ni-NTA磁珠三次（步骤B4至B6）。

8. 加入1×10^10个噬菌体（溶于50 mM Na2HPO4，pH 8.0）。

9. 在4℃旋转混合器上孵育1小时。

10. 在微量离心机中以2000 rpm离心1分钟，沉淀Ni-NTA磁珠，吸去上清液。

11. 加入1 ml预冷的50 mM Na2HPO4（pH 8.0）缓冲液，轻轻混匀。

12. 吸去上清液。

13. 再洗涤Ni-NTA磁珠四次（步骤B10至B12）。

14. 加入100 μl 200 mM咪唑，室温孵育10分钟。

15. 在微量离心机中以2000 rpm离心1分钟，沉淀Ni-NTA磁珠，吸去上清液。

16. 将收集的上清液加入适量细胞（如K91细胞）以扩增筛选的噬菌体（见提示1）。

17. 收集所得噬菌体颗粒，继续C部分。

C. 第三和第四轮噬菌体筛选

1. 向1.5 ml微量离心管中加入20 μl谷胱甘肽-琼脂糖磁珠（Amersham/Pharmacia）。

2. 加入10 μg GST融合诱饵蛋白（溶于100 μl PBS/Triton）。

3. 在4℃旋转混合器上孵育30分钟。

4. 在微量离心机中以2000 rpm离心1分钟，沉淀谷胱甘肽-琼脂糖磁珠，吸去上清液。

5. 加入1 ml PBS/Triton，轻轻混匀，以2000 rpm离心1分钟，沉淀磁珠，吸去上清液。

6. 再洗涤磁珠两次（步骤C5）。

7. 将等体积的分离噬菌体颗粒与收集的谷胱甘肽-琼脂糖磁珠混合。

8. 在4℃旋转混合器上孵育2小时。

9. 以2000 rpm离心1分钟，沉淀磁珠，吸去上清液。

10. 加入1 ml PBS/Triton，轻轻混匀。

11. 以2000 rpm离心1分钟，沉淀磁珠，吸去上清液。

12. 重复PBS/Triton洗涤三次（步骤C10至C11）。

13. 加入300 μl TEV蛋白酶缓冲液，轻轻混匀。

14. 以2000 rpm离心1分钟，沉淀磁珠，吸去上清液。

15. 重复TEV蛋白酶缓冲液洗涤一次（步骤C13至C14）。

16. 向洗涤后的琼脂糖磁珠中加入100 μl TEV缓冲液和3 μl TEV蛋白酶（烟草蚀纹病毒蛋白酶，30单位）。

17. 在30℃旋转混合器上孵育30分钟，洗脱结合的噬菌体。

18. 以2000 rpm离心1分钟，沉淀琼脂糖磁珠。

19. 将收集的上清液加入适量细胞（如K91细胞）以扩增筛选的噬菌体。

20. 分离所得噬菌体，重复C部分一次。

D. 第五和第六轮噬菌体筛选

琼脂糖处理噬菌体的制备（与下方结合子部分并行进行）

1. 向1.5 ml微量离心管中加入50 μl谷胱甘肽-琼脂糖磁珠。

2. 加入1×10^10个噬菌体（溶于200 μl PBS/Triton）。

3. 在4℃旋转混合器上孵育30分钟。

4. 以2000 rpm离心1分钟，沉淀磁珠，收集上清液。

5. 将收集的噬菌体上清液与谷胱甘肽-琼脂糖磁珠混合（如步骤D13所述）。

谷胱甘肽-琼脂糖磁珠与GST融合诱饵蛋白的结合（与上述噬菌体处理并行进行）

6. 向1.5 ml微量离心管中加入20 μl谷胱甘肽-琼脂糖磁珠。

7. 加入10 μg GST融合诱饵蛋白（溶于100 μl PBS/Triton）。

8. 在4℃旋转混合器上孵育30分钟。

9. 以2000 rpm离心1分钟，沉淀磁珠，吸去上清液。

10. 加入1 ml PBS/Triton，轻轻混匀，以2000 rpm离心1分钟，沉淀磁珠，吸去上清液。

11. 再洗涤磁珠两次（步骤D10）。

12. 将收集的谷胱甘肽-琼脂糖磁珠与噬菌体上清液混合（如步骤D13所述）。

噬菌体与琼脂糖磁珠的孵育

13. 将制备的噬菌体上清液（步骤D1至D5）与收集的谷胱甘肽-琼脂糖磁珠（步骤D6至D12）混合。

14. 在4℃旋转混合器上孵育2小时。

15. 以2000 rpm离心1分钟，沉淀磁珠，吸去上清液。

16. 加入1 ml高严格洗涤液，轻轻混匀。

17. 以2000 rpm离心1分钟，沉淀磁珠，吸去上清液。

18. 重复高严格洗涤三次（步骤D16至D17）。

19. 加入300 μl TEV蛋白酶缓冲液，轻轻混匀。

20. 以2000 rpm离心1分钟，沉淀磁珠，吸去上清液。

21. 重复TEV蛋白酶缓冲液洗涤一次（步骤D19至D20）。

22. 向洗涤后的谷胱甘肽-琼脂糖磁珠中加入100 μl TEV缓冲液和3 μl TEV蛋白酶（30单位）。

23. 在30℃旋转混合器上孵育30分钟，洗脱结合的噬菌体。

24. 以2000 rpm离心1分钟，沉淀磁珠。

25. 将收集的上清液加入适量细胞（如K91细胞）以扩增筛选的噬菌体。

26. 分离所得噬菌体，重复D部分一次。

试剂配方

50 mM Na2HPO4, pH 8.0：50 mM磷酸氢二钠（Na2HPO4），pH 8.0。

100 mM NaHCO3, pH 8.5：100 mM碳酸氢钠（NaHCO3），pH 8.5。

Ni-NTA磁珠：Qiagen公司的Ni-NTA-琼脂糖磁珠。

1 M Tris：1 M三羟甲基氨基甲烷。

50 mM甘氨酸, pH 2.0：50 mM甘氨酸-盐酸，pH 2.0。

PBS/Tween溶液：0.1%（v/v）Tween 20，溶于PBS。

PBS：4.3 mM磷酸氢二钠（Na2HPO4），137 mM氯化钠（NaCl），2.7 mM氯化钾（KCl），1.4 mM磷酸二氢钾（KH2PO4）。

1% BSA溶液：1%（w/v）牛血清白蛋白（BSA），溶于100 mM NaHCO3（pH 8.5）。

His6标签诱饵蛋白：溶于100 mM NaHCO3（pH 8.5），终浓度约20 μg/μl。

200 mM咪唑：200 mM咪唑。

TEV蛋白酶缓冲液：随TEV蛋白酶提供（Life Technologies, Inc）。

高严格洗涤液：1%（v/v）Triton X-100，550 mM NaCl，溶于PBS。

PBS/Triton：1%（v/v）Triton X-100，溶于PBS。

耗材

（原文未列出具体耗材）

提示

1. 使用适用于当前噬菌体的纯化方法或进行适配。

2. GST融合蛋白通过将目标蛋白编码基因克隆至pGEXcs构建而成（参考文献2）。所得融合蛋白在GST与目标蛋白之间含有一个TEV蛋白酶位点，允许TEV蛋白酶介导结合噬菌体的释放。

参考文献

1. Han, Y. and Kodadek, T. Peptides selected to bind the Gal80 repressor are potent transcriptional activation domains in yeast. J. Biol. Chem. 2000;275:14979-14984.

2. Parks, T.D., Leuther, K.K., Howard, E.D., Johnston, S.A., and Dougherty, W.G. Release of proteins and peptides from fusion proteins using a recombinant plant virus proteinase. Anal. Biochem 1994;216:413-417.