描述

电穿孔是一种将外源DNA导入酵母细胞的物理方法，通过高压电脉冲瞬时破坏细胞膜通透性，使DNA进入细胞。本方案适用于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等常用菌株，操作简便、转化效率高。

实验步骤

1. 挑取单菌落接种于50ml YEPD培养基中，30°C振荡培养至早期稳定期（约0.6-2×10⁸细胞/ml）。

2. 将培养物转移至50ml无菌锥形管中，4°C、3000rpm离心5分钟，收集细胞，后续操作全程冰上放置。

3. 用40ml冰预冷无菌去离子水重悬细胞，4°C、2500rpm离心5分钟，弃上清。

4. 重复用20ml冰预冷无菌去离子水洗涤一次。

5. 用5ml冰预冷1M山梨醇重悬细胞，4°C、2000rpm离心5分钟，弃上清。

6. 用150μl冰预冷1M山梨醇重悬细胞，务必保持冰浴。

7. 取40μl酵母悬液与<5μl DNA（约5μg）混合，转移至预冷的0.2cm电转杯中，轻敲杯底使样品均匀接触铝板两侧。

8. 施加一次电脉冲：电压1.5kV，电容25μF，电阻200Ω。预期时间常数约4-5毫秒。

9. 立即加入1ml冰预冷1M山梨醇，用无菌巴斯德吸管转移至无菌Eppendorf管中。

10. 涂布于选择性平板，30°C培养2-3天至菌落出现。

试剂配方

YEPD培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖（固体加2%琼脂）。1M山梨醇：称取182.17g山梨醇，加去离子水定容至1L，过滤除菌或高压灭菌。

器材

电穿孔仪（如Bio-Rad Gene Pulser）、0.2cm电转杯、无菌锥形管、离心机、冰浴设备。

注意事项

1. 细胞洗涤和重悬必须使用冰预冷溶液，保持低温以减少细胞损伤。

2. DNA应纯化且无盐离子，推荐使用去离子水或TE缓冲液溶解。

3. 电转杯使用前需预冷，重复使用需彻底清洗并紫外灭菌。

4. 电脉冲后立即加入山梨醇，避免细胞裂解。