描述

本方案适用于熟悉拟南芥转化方法的实验人员，提供一种简化的农杆菌介导的花序浸染法（floral dip）操作流程。

实验步骤

1. 培养健康的拟南芥植株至开花期。在长日照条件下，将植株种植于覆有婚纱网、窗纱或粗棉布的土壤盆中。

2. （可选）剪除初生花序，以促进大量次生花序的萌发。剪除后约4-6天植株即可用于转化。可重复剪除以延迟植株生长。最佳转化植株应具有大量未成熟的花序簇，且已受精的角果较少，但不同发育阶段的植株均可成功转化。

3. 准备携带目标基因的二元载体的根癌农杆菌菌株。在含相应抗生素的LB培养基中于28°C大量培养，以维持二元质粒的选择压力，也可使用其他培养基。可使用对数中期或刚进入稳定期的菌液。

4. 离心收集农杆菌，用5%蔗糖溶液（新鲜配制，无需高压灭菌）重悬至OD600 = 0.8（可适当调整）。每2-3个小盆需100-200 ml菌液，每2-3个3.5英寸（9厘米）盆需400-500 ml。

5. 浸染前，加入Silwet L-77至终浓度0.05%（500 μl/L），充分混匀。若出现L-77毒性问题，可降低至0.02%或0.005%。

6. 将植株地上部分浸入农杆菌菌液中2-3秒，并轻轻搅动。浸染后植株表面应覆盖一层菌液薄膜。部分研究者仅浸染花序，而另一些则同时浸染莲座叶以覆盖较短的腋生花序。

7. 将浸染后的植株置于透明罩或覆盖物下16-24小时，以保持高湿度（必要时可将植株侧放）。避免过度阳光直射（罩内空气可能过热）。

8. 正常浇水和培养植株，用蜡纸、胶带、支架、扎带等固定松散的花序。种子成熟时停止浇水。

9. 收获干燥种子。转化事件通常相互独立，若来自不同植株则可确保独立性。

10. 使用抗生素或除草剂筛选标记筛选转化体。例如，气相灭菌后，将40 mg（约2000粒）种子重悬于4 ml 0.1%琼脂糖中，铺板于含50 μg/ml卡那霉素的0.5×MS/0.8%组织培养琼脂平板上，4°C冷处理2天，然后在连续光照（50-100 μE）下培养7-10天。

11. 将候选转化植株移栽至土壤中，继续培养、检测并用于后续实验。

为提高转化效率，可每隔7天浸染2-3次。建议在剪除花序后2天进行第一次浸染，一周后进行第二次浸染。两次浸染间隔不少于6天。

试剂配方

（本方案未提供具体配方，请参考标准实验室方法）

所需材料

Bechtold, N., Ellis, J., and Pelletier, G. (1993). In planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C. R. Acad. Sci. Paris, Life Sciences 316:1194-1199.

Clough SJ and Bent AF, 1998. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J 16:735-43.

提示

（本方案未提供额外提示）