描述

本文库为L. esculentum（番茄）的VFNT Cherry和Rio Grande-PtoR品系文库。粘粒文库通过EcoRI部分消化总基因组DNA，克隆至pYAC4的BamHI位点构建，经CHEF凝胶电泳分级分离，筛选大小约为150-200 Kb的片段。文库的平均插入片段大小为50至400 Kb。

实验步骤

不同引物组合的测试反应

使用不同DNA来源作为测试模板及后续对照：

• 基因组DNA制备（例如来自Mogeor、M-82品系）
• RAPD反应后的克隆DNA片段
• 筛选后cDNA文库中的克隆DNA插入片段

使用下文所述的YAC-PCR程序和PCR混合液。

YAC超级池筛选

1块96孔微量滴定板，包含来自384个不同YAC克隆的DNA制备物。

PCR混合液

DNA模板 1.0 μl
正向引物 2.0 μl
反向引物 2.0 μl
10X PCR缓冲液 5.0 μl
dNTPs 4.0 μl
Taq DNA聚合酶 2单位
H2O 35.0 μl
总体积 50.0 μl

YAC-PCR程序
步骤1 94°C 2.0分钟
步骤2 94°C 2.0分钟
步骤3 50°C 2.0分钟
步骤4 72°C 2.0分钟
步骤5 返回步骤2，45个循环
步骤6 72°C 5.0分钟
步骤7 4°C 保持

阳性YAC筛选

反应体系：

酵母细胞裂解液（作为模板）5.0 μl
Zymolase（1 mg/ml）5.0 μl
10X PCR缓冲液 2.0 μl
H2O 8.0 μl
总体积 20.0 μl
37°C孵育30分钟

加入PCR混合液：正向引物 1.0 μl
反向引物 1.0 μl
10X PCR缓冲液 3.0 μl
dNTPs 2.0 μl
Taq DNA聚合酶 1单位
H2O 22.0 μl

使用上述YAC PCR程序。

配方

（原文未提供具体内容）

耗材

（原文未提供具体内容）

提示

（原文未提供具体内容）