描述

一种制备用于转化的大肠杆菌感受态细胞的方法。主要优势在于这些细胞可在4摄氏度下保存一周。

步骤

1. 在含有10微克/毫升四环素的LB培养基中培养大肠杆菌XL-1过夜。

2. 取4毫升过夜培养物，加入76毫升含有10微克/毫升四环素的LB培养基中，培养1.5小时（应使其进入对数生长期）。

3. 将培养物置于冰上10分钟。

4. 在临床离心机或同等设备中以2500转/分钟离心10分钟（以沉淀细胞）。

5. 弃上清，用20毫升KMES缓冲液（配方见下方）重悬。

6. 置于冰上1-1.5小时。

7. 再次离心（同步骤4），用4毫升KMES缓冲液重悬。

该细胞悬液可用于转化，并可在4摄氏度下保存最多7天。

转化方案

1. 取300微升上述细胞，与最多50微升连接反应液轻轻混合进行转化。

2. 置于冰上45分钟。

3. 在42摄氏度热激1.5至2分钟。

4. 在冰上恢复1-2分钟。

5. 立即涂板（或若谨慎起见，在37摄氏度恢复30分钟后再涂板）。使用与质粒相应的筛选标记（通常为氨苄青霉素）；注意这些细胞本身具有四环素抗性。

配方

KMES缓冲液：

60 mM CaCl2

20 mM KMES，pH 5.8

5 mM MgCl2

5 mM MnCl2

材料

KMES可从Sigma购买。还需要XL-1 Blue大肠杆菌菌株。

提示

无。