流感H5疫苗临床试验最新进展

可能造成人类大流行的新型流感病毒包括H2、H5、H7及H9等四种亚型，其中H5亚型除了1997年及2003年在香港分别造成十八及两例病例外（图一）  (参考文献1)，近三年（2004~2006）又在全球造成二百例病例以上(参考文献2)。因此，近期内以H5病毒造成全球性大流行的可能性最大，本文将回顾开发新型流感H5疫苗的最新进展。

■1997年候选疫苗

1997年香港流行H5病毒之后，国际医学界针对当时流行的H5流感病毒开发两种候选疫苗进行临床试验(参考文献3、4)。第一种候选疫苗是以基因重组技术，利用杆状病毒（Baculovirus）来生产H5蛋白质以肌肉注射接种两剂，比较五种剂量（25,45,90,90+10微克及安慰剂）及三种接种间隔（21,28或42天），总共十五组，一四七名健康成人完成接种及抽血检验血清抗体。结果显示，抗体反应与剂量有关但与接种间隔无关，基因重组H5蛋白质副作用低但免疫效果不太理想，可能需要辅佐剂来增加免疫效果  (参考文献3)。

第二种候选疫苗是以鸡胚蛋生产H5裂解抗原疫苗，因为野生H5N1病毒对鸡胚蛋及人都是高致病性，不适合做为疫苗种株来生产，经过动物实验发现，一株H5N3病毒(A/Duck/Singapore/3/97)是非致病性病毒且与香港H5N1病毒有相似的抗原性及交叉保护力，因此被选为疫苗株来进行生产，比较三种剂量(7.5,15或30微克)及有无添加辅佐剂(MF59)共六组，以肌肉注射接种两剂，间隔二十一天，六十五名健康成人完成疫苗接种及抽血检验抗体  (参考文献4、5)。结果显示：一、添加辅佐剂会增加局部肌肉酸痛，大部分的疼痛在两天内缓解；二、添加辅佐剂的裂解抗原疫苗比未添加辅佐剂的裂解抗原疫苗的免疫效果较佳；三、与以前的研究比较起来，不活化的裂解抗原疫苗似乎比不活化的全病毒疫苗的免疫效果较差，值得未来进一步研究；四、两剂7.5微克的MF59不活化裂解抗原疫苗已足够在成人产生适当抗体反应；最近以此研究所留下的血清进行交叉抗体检验，结果显示接种A/Duck/Singapore/3/97所产生的抗体无法有效中和2004年的H5N1病毒(参考文献6)。

■以反向基因技术来开发人用禽流感疫苗

常规季节性疫苗中的A/H1及A/H3亚型目前是利用传统基因重排技术(classical  reassortment)来制备高产量疫苗种株(图二)；有鉴于高致病性禽流感病毒很有可能造成人的病例，这些病毒又不适合直接生产疫苗，世界卫生组织于2003年11月发布规范(参考文献7)，提出以反向基因技术(reverse  genetics  or  plasmid  rescue)来生产人用禽流感病毒疫苗。首先将高致病性禽流感疫苗的HA及NA基因转变成DNA质体，并将HA基因上的高致病性基因切除，然后将此修改过后的HA质体及NA质体，再加上取自鸡胚蛋高产量疫苗株(A/PR/8/34  H1N1)的其它六段内部基因质体，此八段质体一起加到细胞培养即可选殖出低致病性的H5N1流感病毒疫苗株，作为生产H5疫苗的种株(图二)。以反向基因选殖出来的H5N1流感病毒疫苗株，必须在鸡及雪貂证实其低致病性。除了八段质体之外，也有十二段质体的方法可使用。

世界卫生组织在其2003年的规范中，已针对「反向基因技术开发人用禽流感疫苗」进行生物安全危险评估(biosafety  risk  assessment)，当从高致病性禽流感病毒以反向基因技术选殖疫苗种株时，必须在BSL3+  or  4的实验室进行，此疫苗种株在鸡及雪貂证实其低致病性后，即可在BSL2+下进行疫苗研发及制造。为避免H5N1疫苗种株与人流感病毒(意即H1、H3及B型)发生基因重排(reassortment)，工作人员需接种季节性疫苗，以减少感染人流感病毒的机会。如果H5疫苗核准使用时，工作人员需优先接种H5疫苗。此外，必须备有抗病毒药物作为意外暴露时预防投药。

■如何核发大流行用流感疫苗的上市许可？

一般疫苗要经过三期的临床试验证实其安全性及有效性，才能取得上市许可，但流感大流行发生时可能会迅速造成全球流行，因此没有时间按照一般疫苗的上市核可程序。为了解决此一难题，欧洲医药管理局(European  Medicines  Evaluation  Agency)于2004年4月颁布规范来快速审核大流行用疫苗的上市申请(参考文献8)，以H5疫苗说明如下：一、在大流行还未发生时，以上述的Vietnam  2004  H5N1疫苗株进行模拟生产(mock-up  vaccine)，建立最佳的生产条件；二、进行临床前试验(亦即动物实验)证实模拟疫苗的安全性、致免疫力及保护力；三、进行临床试验证实安全性及致免疫力；四、提出上市申请；五、通过审核后，必须再提出临床研究计划书作为未来评估H5疫苗紧急接种后的安全性、免疫反应及保护力。

因模拟疫苗可能与真正造成流感大流行的H5病毒有很大的差异而无法提供最佳保护力，因此当真正大流行开始时，将高致病性流行病毒株以反向基因技术转殖成低致病性疫苗株，立刻以已建立的最佳条件生产H5疫苗，并将前几批的疫苗进行动物试验以证实其致免疫力及保护力，然后申请使用执照，通过后即可开始进行紧急疫苗接种，同时根据事先拟定的临床研究计划书，评估此H5疫苗在人体的安全性、免疫反应及保护力，以决定是否更改疫苗接种策略，并做为未来制订流感大流行时的疫苗政策的参考。

■2004年候选疫苗

当2004年越南出现人病例之后，动物实验显示越南2004年H5N1病毒的抗原性已与香港1997年H5N1病毒有所不同，因此世界卫生组织立刻委托美国及英国的实验室分别用八段质体及十二段质体方法开发出两株2004年H5N1疫苗种株（A/Vietnam/1203/2004及A/Vietnam/1194/2004），并免费提供给想要生产H5N1疫苗的机构及厂商。为了整合大流行用疫苗的临床试验，世界卫生组织分别于2005年11月及2006年5月召开会议。目前共有二十四个H5疫苗的临床试验计划正规划中或已进行，其中二十个是以胚胎蛋培养病毒，三个是以细胞培养病毒，一个是以基因工程表达M2蛋白而无需进行病毒培养(表一)。这些试验的临床试验材料大都在生产季节性流感疫苗的厂房来生产，因为传统的季节性流感疫苗大都是以鸡胚蛋来生产，因此目前的H5候选疫苗大都是由鸡胚蛋生产。不过，2006年5月4日，美国NIH宣布赞助五家疫苗公司(GSK、MedImmune、Novatis、DynPort及Solvay)共约十亿美元来开发细胞培养的流感疫苗，相信不久的将来，细胞培养将成为生产流感疫苗的主要技术。

■美、法、匈已完成临床试验

截至2006年5月共有三个H5疫苗的临床试验已完成数据分析。第一个完成的临床试验是由美国NIH委托Sanofi  Pasteur生产的裂解病毒疫苗，此试验比较五种剂量(7.5、15、45、90微克及安慰剂)，肌肉注射两剂疫苗，间隔二十八天，共四五一名十八至六十四岁美国成人完成疫苗接种及抽血检查抗体反应(参考文献9)。结果显示：注射部位轻微疼痛是最常见的副作用，只有接种两剂高剂量疫苗的个案才有明显的抗体反应，中和抗体效价大于1:40的百分比分别为9%、22%、43%及54%。

第二个完成临床试验是由Sanofi  Pasteur在法国生产的裂解病毒疫苗，此试验比较三种剂量(7.5、15及30微克)及有无添加辅佐剂(氢氧化铝)共六组，肌肉注射两剂，间隔二十一天，共有三百名十八至四十岁的法国成人完成疫苗接种及抽血检查抗体反应(参考文献10)。结果显示：只有轻微副作用发生，最高剂量(30微克)并添加辅佐剂的配方产生最高的抗体反应，在低剂量(7.5及15微克)的组别，添加辅佐剂并未提升免疫反应，接种两剂后，HI抗体大于1:32的百分比分别为43%(7.5微克)、28%(7.5微克加辅佐剂)、44%(15微克)、44%(15微克加辅佐剂)、52%(30微克)、67%(30微克加辅佐剂)，而中和抗体上升四倍以上的百分比分别为20%、16%、22%、18%、27%及41%。

第三个完成的临床试验是由匈牙利卫生部委托该国Omninvest公司所生产的不活化全病毒疫苗，剂量为6微克，并以磷酸铝(AlPO4)为辅佐剂，肌肉注射一剂，共有一四六名成人完成疫苗接种及抽血检查抗体反应，结果显示：29%的接种者出现局部疼痛，但只持续一天；HI抗体效价大于1：40以上的百分比为63%(匈牙利卫生部未发表的资料)。

■台湾刻正演练疫苗生产

最近的研究显示:2004年以后在人体分离出来的H5N1流感病毒，可区分成二种基因型。第一基因型主要分布于中南半岛，如越南及泰国，第二基因型主要分布于中国、印度尼西亚及土耳其(参考文献11)。动物研究显示，此二基因型的抗原性不同，因此可能不具交叉保护力。前面所提到的2004年越南疫苗株是属于第一基因型，目前WHO正将2005年由印度尼西亚分离出来的第二基因型病毒以反向基因技术来制备疫苗种株(参考文献11)。

台湾疾管局于2005年4月从位于英国的WHO参考实验室（NIBSC）引自疫苗种秼NIBRG-14（A/VietNam/1194/2004），因为国内民间厂商缺乏流感疫苗自制能力（国光疫苗公司的流感疫苗产品是由日本进口疫苗原液在台进行分装），所以委托国家卫生研究院疫苗研发中心以鸡胚蛋及细胞培养演练生产技术，并进而生产临床试验材料来进行临床试验，同时也可紧急生产疫苗原液，以备不时之需。

■批注资料

(参考文献1).Iain  Stephenson,  et  al.  Confronting  the  avian  influenza  threat:  vaccine  development  for  a  potential  pandemic.  Lancet  Infect  Dis  4:499-509,  2004.

(参考文献2).认识H5N1新型流感。国家卫生研究院台湾流感研究小组，2006年4月，第二版。

(参考文献3).John  Treanor,  et  al.  Safety  and  immunogenicity  of  a  recombinant  hemagglutinin  vaccine  for  H5  influenza  in  humans.  Vaccine  19:  1732-1737,  2001.

(参考文献4).Karl  G  Nicholson,  Anthony  E  Colegate,  Audino  Podda,  et  al.  Safety  and  antigenicity  of  non-adjuvanted  and  MF59-adjuvanted  influenza  A/Duck/Singapore/97  (H5N3)  vaccine:  a  randomised  trial  of  two  potential  vaccines  against  H5N1  influenza.  Lancet  357:  1937-1943,2001.

(参考文献5).Iain  Stephenson,  Karl  G.  Nicholson,  Anthony  Colegate,  et  al.  Boosting  immunity  to  influenza  H5N1  with  MF59-adjuvanted  H5N3  A/Duck/Singapore/97  vaccine  in  a  primed  human  population.  Vaccine21:  1687-1693,2003.

(参考文献6).Iain  Stephenson,  Roberto  Bugarini,  Karl  G.  Nicholson,  et  al.  Cross-Reactivity  to  Highly  Pathogenic  Avian  Influenza  H5N1  Viruses  after  Vaccination  with  Nonadjuvanted  and  MF59-Adjuvanted  Influenza  A/Duck/Singapore/97（H5N3）  Vaccine:  A  Potential  Priming  Strategy.  The  Journal  of  Infectious  Diseases  191:1210-1215,  2005.   (责任编辑：泉水)

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