Ficoll密度梯度离心法是分离人外周血单个核细胞（PBMC）的经典方法，广泛应用于免疫学、血液学及临床研究。该方法利用细胞密度差异，通过特定比重（1.077±0.001）的聚蔗糖-泛影葡胺分层液，将单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）与红细胞、粒细胞分离，获得高纯度、高活性的细胞群体。
原理：Ficoll（蔗糖多聚体，分子量约400,000）与泛影葡胺混合形成密度梯度介质。红细胞和粒细胞密度大于分层液，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞密度小于或等于分层液，漂浮于液面或悬浮其中。吸取界面云雾层即可获得PBMC。
操作步骤：
- 在离心管中加入适量淋巴细胞分离液（如Ficoll-Paque）。
- 取肝素抗凝静脉血，与等量Hank's液或RPMI 1640混匀，沿管壁缓慢叠加于分离液上，保持界面清晰。水平离心2000 rpm×20分钟。
- 离心后分为三层：上层为血浆和稀释液，中层为分离液，下层为红细胞和粒细胞。上中层界面处可见白色云雾层（PBMC，含少量血小板）。
- 用毛细吸管小心吸取云雾层细胞，转移至新管，加入5倍体积Hank's液或RPMI 1640，1500 rpm×10分钟洗涤两次。
- 弃上清，用含10%胎牛血清的RPMI 1640重悬细胞。取一滴与0.2%台盼蓝混合，计数活细胞（活细胞不着色，死细胞染蓝）。
注意事项：操作需无菌，离心加速/减速应平稳以维持界面；小鼠等动物淋巴细胞比重不同，需调整分离液密度（如Percoll）。
试剂配制：
- Hank's液（无Ca²⁺、Mg²⁺）：NaCl 8.0 g, KCl 0.4 g, Na₂HPO₄·12H₂O 0.12 g, KH₂PO₄ 0.06 g, 葡萄糖1.0 g, 双蒸水至1000 ml, 1%酚红2 ml, 8磅15分钟灭菌，pH 7.3-7.6。
- 细胞分层液：9%聚蔗糖24份与34%泛影葡胺10份混合，比重1.077-1.078，G5滤器过滤除菌。
- RPMI 1640培养液：RPMI 1640粉末1袋溶于1000 ml三蒸水，调pH 7.2-7.4，过滤除菌。完全培养液含10%灭活胎牛血清。
该方法分离的PBMC纯度>90%，收获率80-90%，活细胞率>95%，是后续功能实验（如淋巴细胞增殖、细胞因子检测）的基础。