TUNEL标记法是一种用于检测细胞凋亡中DNA断裂的经典技术。本方案针对大鼠脑组织50微米厚度的漂浮切片进行优化，并可结合Fluoro-Jade染色用于神经退行性研究。以下步骤基于Trevigen TACS 2 TdT-Fluor原位凋亡检测试剂盒（Trevigen，电话：1-800-TREVIGEN）进行改良，主要改动在于将试剂盒自带的链霉亲和素-荧光素替换为链霉亲和素-Alexa 594（来自Molecular Probes，电话：1-800-438-2209）。尽管Fluoro-Jade在罗丹明光谱中有少量激发和发射，但Alexa 594的荧光强度远高于重叠信号，因此TUNEL阳性细胞可清晰分辨。也可尝试使用链霉亲和素-Cy5（在DAPI光谱中发光，不与Fluoro-Jade重叠），但本方案未经验证。

注意：若不进行Fluoro-Jade共染，Trevigen的链霉荧光素或其他标记物可能同样适用，但本方案未测试。

实验步骤：

1) 将自由漂浮切片在0.1 M PBS中水化（切片应已处于该溶液中）。

2) 细胞透化：使用CytoPore（不稀释），4°C冰箱过夜（可缩短至1小时）。注意：后续所有步骤中，液体只需刚好覆盖组织切片（通常约200-300微升），但必须确保组织无折叠，否则染色会极不均匀甚至部分区域不染色。建议在未处理的Falcon 24孔板中每孔放置1张切片。使用玻璃吸管（尖端用本生灯烧钝并弯成90度角）转移组织。所有孵育和洗涤步骤中，组织需适度振荡（150-300 RPM）。

3) 用去离子水洗涤3次。

4) 将10×标记缓冲液稀释至1×，确保足够用于步骤5和6。

5) 将组织放入1×标记缓冲液中孵育5分钟。

6) 制备标记混合液： - 1×标记缓冲液（来自步骤4）：100微升 - 阳离子（Mn+）：2微升/100微升 - 1×核苷酸缓冲液（TdT dNTP混合物）：2微升/100微升 - TdT酶（务必最后加入）：2微升/100微升

7) 将组织加入标记混合液中，孵育75分钟。

8) 将10×终止缓冲液稀释至1×。

9) 反应结束后，将组织加入1×终止缓冲液中，孵育5分钟。

10) 用0.1 M PBS洗涤3次。

****** 从本步骤开始，后续操作应尽可能避光。

11) 制备二级标记溶液：使用链霉亲和素-Alexa 594或其他链霉亲和素偶联的二抗，以1:200稀释于含0.5%正常山羊血清的0.1 M PBS中。

12) 用0.1 M PBS洗涤3次。

13) 进行Fluoro-Jade染色或其他第二标记。

14) 用DPX封片剂（Electron Microscopy Sciences, Inc）封片。

保护Alexa 594免受光漂白的提示：在暗光下配制溶液；染色时用铝箔包裹染色盘；必要时短暂将切片暴露于光线下，然后迅速放回暗处（如空抽屉）或其他避光方法。