PC12细胞培养与融合实验方案

细胞培养

材料

1. Falcon Primaria培养皿。

2. 培养基：含谷氨酰胺的DME（或F12K）培养基，添加7%热灭活马血清（56°C，30分钟）、7%胎牛血清、50单位/毫升青霉素、50微克/毫升链霉素，37°C保存。

3. ECL基质（E-C-L细胞附着基质，Upstate Biotech，08-110）：分装为250微升/管，储存于-80°C。需始终低温保存，否则会形成凝胶。

4. F12K培养基（无添加剂）：用于稀释ECL基质。

5. 盖玻片培养皿：向一管ECL分装液中加入12毫升冷的（4°C）F12K培养基，涡旋混匀。每个盖玻片培养皿加入2-3毫升，在培养箱中孵育至少1小时。使用前用培养基替换ECL溶液。

步骤

1. 将细胞接种于Primaria培养皿。细胞以3-5个细胞簇的形式生长。每周换液3次，每次仅更换2/3的培养基。

2. 当细胞密度过高或细胞簇变大（每个簇超过6-8个细胞）时，应通过轻柔吹打分散细胞，避免使用STE或胰蛋白酶。将分散的细胞以较低密度（1:3或1:4）重新接种到新鲜培养皿中。不要过度稀释。

3. 在荧光观察前2-7天，可将DME培养基替换为F12K培养基，以减少自发荧光。

4. 细胞冻存：将细胞悬浮于90%培养基和10% DMSO中，缓慢冷冻（与其他细胞系相同），然后转移至液氮中保存。

参考文献

L.A. Greene, J.M. Aletta, A. Rukenstein and S.H. Green (1987) PC12 pheochromocytoma cells: culture, nerve growth factor treatment, and experimental exploitation. Methods Enzymol. 147:207-216.

细胞融合

材料

1. 60毫米培养皿中的PC12细胞储备。最佳密度为细胞簇（3-5个细胞）均匀分布。

2. PEG/DME：在100毫升培养基瓶中高压灭菌10克PEG（PEG1500，BDH limited，29575），然后立即加入10毫升温热的（37°C）DME（无添加剂），旋摇至溶液均一。使用前加热至37°C。室温保存，使用前加热至37°C。

3. DME（无添加剂），37°C。

4. F12K培养基，37°C（见细胞培养部分）。

5. STE，37°C。

6. 0.25%胰蛋白酶，37°C。

步骤

1. 移除培养基，轻轻向培养皿中加入2毫升PEG/DME。

2. 精确孵育1分钟。

3. 移除PEG/DME，用2毫升DME轻轻冲洗培养皿3次。

4. 加入新鲜F12K培养基，在37°C孵育20分钟。

5. 移除培养基，用STE轻轻冲洗。

6. 用胰蛋白酶轻轻冲洗并立即移除。

7. 1-2分钟后，将细胞吹打下来，接种到含有培养基的新鲜培养皿（或包被的盖玻片培养皿）中。通常培养基中加入NGF以启动诱导（见分化诱导部分）。

参考文献

P.H. O'Lague and S.L. Huttner (1980) Physiological and morphological studies of rat pheochromocytoma cells (PC12) chemically fused and grown in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:1701-1705.

分化诱导

材料

1. 神经生长因子（2.5S NGF，Bioproducts for Science）：用50 mM醋酸钠（pH 5.0）配制1毫克/毫升储备液。无菌过滤，分装为5微升/管，储存于-80°C。

2. NGF培养基：向每管NGF分装液中加入1毫升F12K培养基，涡旋混匀。取120微升加入3毫升培养基中，终浓度为200纳克/毫升。

3. Forskolin（Calbiochem 344270）或7-beta-deacetyl-7 beta-(gamma-N-methyl-piperazino)-butryl forskolin（Calbiochem 344273）：用95%乙醇配制20 mM储备液，储存于-20°C。

4. Forskolin-NGF培养基：NGF培养基中加入7.5微升forskolin储备液。

步骤

1. 在NGF培养基中培养细胞2-3天。

2. 移除培养基，加入forskolin-NGF培养基。应在20分钟内观察到快速的神经突延伸。