2  miRNA  前体的转运出核  



　　由于动物的  pre-miRNA  需要胞质中的  Dicer  酶进行进一步加工，转运出核就成为  miRNA  成熟过程中必需的一步。这一过程是通过依赖  RanGTP/exportin  5  的转运机制来完成的。在细胞核中，RanGTP  的浓度较高，Exportin  5  (Exp5)  就可以促进  pre-miRNA  从  Drosha  复合体中释放，并且与之结合，将其带到核外。由于胞质中  RanGTP  的浓度较低，Exp5  就释放  pre-miRNA，使之与  Dicer  结合进行下一步的切割。在运输过程中，miRNA  前体的3'突出将有利于其进入运出核的途径。  



3  Pre-miRNA  的剪切与  miRNA  的成熟  



　　在动物细胞核中，Drosha  的切割产生了成熟  miRNA  的一端(3'端)。另一端的切割成熟是由胞质中另一类核糖核酸酶Ⅲ  Dicer  切割产生的。Dicer  首先是在研究小干扰  RNA(siRNA)  引起的基因沉默中被发现的，后来发现它在  miRNA  的成熟过程中也起着重要的作用。Dicer  参与  miRNA  的成熟过程与  RNA  干扰中产生双链  RNA  的过程很相似：首先  Dicer  识别  pre-miRNA  的双链部分，其与茎环基部的5'端被磷酸化、3'端有突出的结构有很高的亲和力。然后，茎环基部的两圈螺旋解开，  Dicer  对两条链都进行切割，将前体的其余部分切掉，生成5'端磷酸化、3'端有2  nt  突出的类似于  siRNA  的不完全配对的双链。这条  RNA  双链是由成熟  miRNA  与  miRNA*  组成的(见图1a中的第4步)。miRNA*  是  pre-miRNA  上的一段  RNA，其位置恰好与成熟的  miRNA  相对。虽然  Dicer  在对  pre-miRNA  的加工过程中能够产生  RNA  双链中间体，但是这种中间体通常寿命比较短暂而不易被探测。不过，如果大量的前体均可产生并只产生一种  miRNA，则其双链中的星号链也可以成为成熟的  miRNA。  



　　就现有的动物  miRNA  成熟的模型来看，最初由  Drosha  介导的切割特异性决定了  miRNA  前体中  Dicer  的切割位点，从而决定了成熟  miRNA  的两端。由  Drosha  而不是  Dicer  决定这一特异性是由于研究表明  Drosha  对非特异性双链  RNA  的切割效率很差，而  Dicer  可以没有序列依赖性地切割任何  RNA  双链。并且  Drosha  的切割还依赖于  pri-miRNA  茎环基部的二级结构，以及茎环基部外侧125  nt  范围内的序列。  



4  植物  miRNA  的成熟过程  



　　植物  miRNA  的成熟过程与动物有所不同，因为植物中没有  Drosha  的同源类似物。在植物中通常很难检测到  pre-miRNA，即使在  DCL1  突变的植物中也很少检测到。DCL1  是植物  miRNA  成熟过程中类似于  Dicer  的蛋白质，它是位于核内的。这就说明在植物中可能有其他酶(很有可能是  DCL1  )行使了  Drosha  的功能，对  miRNA  的转录初产物进行第一次切割，并且决定了成熟的  miRNA  的序列。(如图1b中的第2步)。在  miRNA  离开细胞核之前，DCL1  (或其他酶)又进行了第二次切割，相当于动物细胞中  Dicer  对  pre-miRNA  的切割(如图1b中的第3步)。然后，可能是由  HASTY  (Exportin-5  在植物中的同源类似物)负责将  miRNA：miRNA*  双链转运出细胞核(图1b中的第4步)。由于经核内连续两次切割，在植物中才难以检测到  pre-miRNA  样的  RNA。  



　　拟南芥(Arabidopsis  thaliana)  作为植物中的一种模式生物，对其  miRNA  的研究是最多的。最近，对拟南芥  miR163  的研究进一步揭示了植物  miRNA  的成熟过程。拟南芥的基因组编码4种  Dicer  样的酶  (DCL1-DCL4)。其中  DCL1  是与  miRNA  的积累相关的，DCL2  和  DCL3  分别参与了由病毒引起的小干扰  RNA(siRNA)  和内源性  siRNA  (例如反转座子  siRNA)  的合成。拟南芥  miR163  是单独转录的，由  RNA  聚合酶Ⅱ催化合成，其转录初产物  pri-miR163  需要经过核糖核酸酶Ⅲ样的酶切割三次才能成为成熟的  miRNA。第一步是在  pri-miR163  的茎环结构的根部进行切割，得到长  miR163  前体  (pre-miR163)，第二步是对长  pre-miR163  中成熟的  miRNA  的3'根部进行剪切，得到短的  pre-miR163，最后是由短的前体切割出成熟的5'端成为成熟的  miRNA  (图2)。有趣的是，在整个剪切的过程中，四种小分子都可以被释放出来。进一步实验证明，拟南芥的  DCL1  至少可以对第一及第二步切割反应进行催化，即对  pri-  和  pre-miRNA  都可以切割。另外，第三步的切割反应可能也是  DCL1  催化的。所以拟南芥的  DCL1  蛋白参与了  miRNA  成熟的全过程。由于拟南芥的  DCL1  蛋白有两个类核定位信号，因此植物的  miRNA  的成熟是在细胞核中完成的。同时，研究表明，植物  DCL1  蛋白的双链  RNA  结合区在决定第一次和第二次的切割位点时是十分重要的。在  dcl1-9_dcl1-9  的突变体当中仍然有21  nt  的  RNA  片段产生，是因为虽然  dcl1-9  蛋白在随机位置上剪切  pri-miRNA163，但是却能准确量出第一次切割的位置到下一次切割的位置为21  nt。