高效液相色谱仪（HPLC）是生物化学、药物分析等领域中常用的分离分析工具。以下为常规操作步骤及注意事项，适用于标准反相色谱分析。

1. 流动相准备：使用色谱纯溶剂，水需为20 MΩ·cm去离子水。根据实验需要选择适当孔径的滤膜（如0.45 μm或0.22 μm）过滤流动相，然后超声脱气10-20分钟，避免气泡影响基线稳定性。

2. 仪器启动与连接：打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接流动相管道和检测系统。确保所有管路无泄漏。

3. 系统冲洗：若长时间未用或更换流动相，需冲洗泵和进样阀。冲洗泵时，在泵出口用针头抽取；冲洗进样阀时，在手动菜单下点击“purge”再点击“start”，流速不超过10 mL/min。

4. 设置流速与基线监测：在手动界面调节流速，初次使用新流动相时先测试压力，流速越大压力越大，通常不超过2000 psi。点击“injure”选择合适流速，点击“on”走基线，观察基线是否平稳。

5. 方法编辑：点击“file”选择“select users and methods”可调用现有方法；或点击“new method”新建方法，配置进样阀、泵、检测器等参数。在“protocol”中设置完整步骤：a. 进样前稳流2-5分钟；b. 基线归零；c. 进样阀的loading-inject转换；d. 走样时间（根据样品调整）。

6. 进样与后处理：选定方法后点击“start”，所有样品需经0.45 μm滤膜过滤后进样。方法运行结束后点击“postrun”记录数据。全部样品完成后，用相同方法走一段基线清洗系统。

7. 关机：先关闭计算机软件，再关闭液相色谱仪硬件，最后填写登记本并由负责人签字。

注意事项：

• 流动相必须严格过滤并脱气，避免气泡进入色谱柱。
• 首次使用新方法时，先不连接色谱柱，待系统稳定后再接柱，防止压力冲击损坏柱子。
• 所有过柱液体均需过滤，压力不超过2000 psi。
• 色谱柱使用后需按规定冲洗保存，延长寿命。