癌症和干细胞生物学的飞速发展凸显出稀有细胞的重要性。尽管新一代测序技术在基因表达研究上无比强大，但它们对如此少量的细胞还是无能为力。到目前为止，很多方法都需要多步样品制备和扩增，这样就有可能引入人为误差，让表达谱不甚准确。于是，我们需要更高保真性的方法。



为了绘制极少量细胞的数字基因表达谱，美国Helicos生物科学公司的Fatih  Ozsolak和哈佛医学院的David  T  Ting等扩展了单分子测序（SMS）技术，开发出少量数字基因表达谱（low-quantity  digital  gene  expression,  LQ-DGE）的应用。此成果发表在最新一期的《Nature  Methods》上。





利用LQ-DGE，Ozsolak等在无扩增步骤的情况下绘制出低至250个细胞的mRNA图谱。他们修改了Helicos的数字基因表达谱方法，在poly(dT)引物包被的流动槽中捕获poly(A)+的mRNA，并直接在测序仪表面开展cDNA的合成，减少了样品操作，因此提高了灵敏度。



为了确定LQ-DGE与标准DGE方法的关系，研究人员比较了4×106个细胞的DGE图谱和1×103个细胞的LQ-DGE表达谱。结果表明两个数据组存在正相关。之后，他们又用LQ-DGE对微量的降解RNA进行图谱分析，发现新鲜样品与FFPE  RNA样品的LQ-DGE图像之间存在很强的相关性。



为了证明他们的方法适合相关细胞群体的比较，并能回答生物学相关的问题，作者们分析了两个相关但截然不同的细胞类型：SM25和490。SM25来自胰腺上皮内肿瘤病变，KrasG12D  突变在胰腺特异表达。而细胞系490是来自恶性胰腺导管腺癌病变。他们鉴定出2000多个差异表达的转录本，并通过qRT-PCR验证了其中一部分，证实了LQ-DGE在鉴定相关细胞的微小差异上的能力。



作者认为，与其他低样品量的RNA图谱分析技术不同，LQ-DGE不需要分离RNA或选出mRNA，而是利用高亲和力的RNA-DNA杂交动力学，在流动槽表面直接捕获poly(A)+模板。它也不含片断化或大小选择的步骤，从而将偏向性降至最低，特别是对短的转录本。



然而，尽管LQ-DGE是传统数字表达谱的重大改进，但它还不能提供完整的转录组覆盖，因为它只检测约8500个转录本。此外，它是对双链DNA测序，这也有一些问题，比如反转录效率低等。这些问题也在一定程度上限制了LQ-DGE的应用。（生物通  薄荷）



解析正常和病态生理过程的有力工具是全基因组分子遗传和表观遗传图谱。其中获得细胞机能完整图谱最主要的挑战之一，就是开发出一种能够描述少量细胞多层次图谱特征的技术。最新一期《自然—方法学》（Nature  Methods）发表的两篇文章解决了这个问题。



在过去的15年里，出现了许多研究基因组图谱的方法，包括从生物芯片到最新的单分子测序平台。但是，由于每个器官由不同类型的细胞组成，而其中许多类型的细胞数量很少，这使得对细胞在表观组和转录组水平图谱的研究变得缓慢。



美国Helicos生物科学公司的Fatih  Ozsolak及其同事发明了一种名为“少量数码基因表达"（LQ-DGE）的新方法。作者利用该方法对少至250个的细胞不用扩增就可以得到其mRNA图谱。他们通过改善Helicos的DGE方法，即从poly(dT)包裹的流动细胞上捕获poly(A)+  mRNA，并直接在细胞表面完成cDNA合成与测序，减少了样品操作并提高了样品敏感性。



麻省陆军总医院的Bradley  E  Bernstein小组介绍了在有限小鼠造血祖细胞应用的“结合高通量测序的染色质免疫共沉淀”（ChIP-seq）方法。作者利用ChIP-seq绘制了1000个细胞的组蛋白修饰图谱，从而了解了小鼠造血祖细胞的发育模式。



随着技术提高，少量细胞多层次图谱有望成为现实。我们有望看到特定细胞在全基因组水平的遗传、基因表达、DNA和组蛋白修饰图谱。