【关键词】  地高辛配基

    Optimization of  digoxigenin in situ hybridization detection of neuropeptide Y expression

　　WU YongFei, ZHANG JianHua, LI ShengBin

　　1State Key Laboratory of Forensic Sciences, Xian Jiaotong University College of Medicine, Xian 710061, China,  2Department of Cell Biology, Neurobiology and Anatomy, University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, Ohio 45267,USA

　　【Abstract】  AIM: To optimize Digoxigenin (Dig) in situ hybridization (ISH) detection of neuropeptide Y (NPY) expression in mouse hippocampus. METHODS:  The Diglabeled RNA antisense and sense probes for NPY were prepared by in vitro transcription. Kainic acid (KA) was taken to induce NPY expression in the mouse hippocampus. Mice were sacrificed 2 hs after KA injection and sections of 12 μm thickness were used for analysis. The influence of different pH of the fixative, different fixation time, different prehybridization treatment, and different prehybridization and hybridization solutions were compared. RESULTS:  Different pH of the fixative from 7.5 to 9.5 did not have noticeable influence on the hybridization signals. Thirtyminute  fixation time was enough to obtain good result. Prehybridization treatment with Triton X100 or mild digestion by proteinase K (PK) resulted in reduced tissue preservation and signal intensity compared to the untreated section. Salmon sperm DNA of 40 mg/L or 250 mg/L of bakers yeast RNA was sufficient to avoid background problem as did Denhardts solution. CONCLUSION:  A simple and effective protocol is developed for Dig ISH detection of NPY expression.

　　【Keywords】 in situ hybridization; digoxigenin; neuropeptide Y; brain section

　　【摘要】 目的： 优化用地高辛标记的原位杂交法检测小鼠海马结构中神经肽Y的表达. 方法： 用体外转录法获得地高辛标记的神经肽Y的反义和正义RNA探针. 用kainic acid诱导小鼠脑组织中神经肽Y表达，2 h后牺牲小鼠，制备12 μm 厚的海马组织切片. 然后比较不同pH值(7.5~9.5) 的固定剂，不同的固定时间，不同的杂交前预处理，以及不同预杂交及杂交液对杂交信号的影响. 结果： 从pH 7.5~9.5，不同碱性固定液对杂交信号没有明显影响. 30 min的固定时间足以获得满意的杂交结果. 用蛋白酶K部分消化切片或用Triton X100 打孔反而降低了杂交信号. 40 mg/L Salmon sperm DNA或250  mg/L bakers yeast RNA可获得与Denhardts 杂交液相同的杂交信号. 结论： 通过优化，我们获得了一种简便而又有效的地高辛标记的原位杂交法，用于检测神经肽Y表达.

　　【关键词】 原位杂交；地高辛配基；神经肽Y；脑切片

　　0引言
 
　　近年来，应用非同位素标记的原位杂交法已大大缩短了显影时间并提高了组织分辨率［1,2］. 地高辛标记的原位杂交法是最广泛使用的非同位素检测方法. 由于尚缺乏成熟的用于检测脑组织内神经肽Y表达的非同位素分析方法，因此我们比较了目前常用的一般的几种地高辛标记原位杂交实验方法，以便得到优化的用于分析神经肽Y表达的原位杂交方法.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　实验所用动物为8~10 wk龄的C57BL/6小鼠，共4只，体质量28~32 g. 实验前3 d，所有小鼠单独饲养. 日夜时间为12/12 h. 所用实验程序经辛辛那提大学动物保护和使用委员会批准，并严格遵守NIH实验动物保护和使用准则. 小鼠饲养于一种严格控制的环境内，可自由获取食物和水. 我们采取所有必要的措施以减轻动物的痛苦并最大限度地减少所用动物的数量. Kainic acid购于Sigma公司. 溶于生理盐水后用NaOH中性化. 按每公斤体质量20 mg的剂量经ip于小鼠体内.

　　1.2方法
 
　　1.2.1地高辛标记的神经肽Y反义RNA及正义RNA探针制备含有561 bp长的神经肽Y基因的质粒载体PT7T3DPac来于辛辛那提大学微阵列中心. 载体先经EcoRⅠ或HindⅢ切割以获得线性质粒. 用EcoRⅠ线性化的模板含有T3启动子，用于转录反义探针. 用HindⅢ线性化的模板含有T7启动子，用于转录正义探针，作为阴性对照. 20 μL的转录体系含有： 4  μL  5×转录缓冲液, 1  μL线性DNA, 2   μL NTP（DigUTP）, 2  μL  0.1 mol/L DTT, 9  μL H2O, 1 μL RNase inhibitor, 1 μL RNA聚合酶（T3或T7），37℃水浴2 h，加2U DNase，37℃孵育15 min以去除DNA模板，用2 μL 0.2 mol/L EDTA pH 8.0终止反应，加2.5 μL 4 mol/L LiCl和75 μL -20℃预冷100%乙醇，混匀后，-20℃放置2 h， 2~8℃离心（44 500 g, 15 min），弃上清，真空干燥，加100  μL  DEPC水37℃溶解30 min，-80℃贮存备用.

　　1.2.2切片制备和杂交KA注射后2 h，用颈椎离断法牺牲小鼠，快速分离脑组织，包埋于干冰5 min，-80℃存放至少48 h后，作12 μm厚的冠状切片，收集于经DEPC处理后的Superfrost plus玻片上，室温干燥30 min后，存于-80℃备用. 用40 g/L多聚甲醛固定后，用PBS（经DEPC处理）漂洗2×15 min，随即进行杂交反应. 用Yeast RNA预杂交液（DEPCtreated 5×SSC, 500 mL/L formamide, 250 mg/L bakers yeast RNA, 50 g/L dextran, 0.2 g/L RNase free BSA），58℃孵育2 h，然后加含有200~400 mg/L探针的杂交液500 μL，在湿化的杂交盒内58℃过夜孵育，用2×SSC室温漂洗30 min，65℃漂洗1 h，0.1×SSC 65℃漂洗1 h，在buffer 1 (0.1 mol/L Tris pH 7.5, 0.15 mol/L NaCl)中作用5 min，用含有100 mL/L灭活羊血清的buffer1中封闭60 min，在含有1∶1000 Ap标记的抗Dig抗体的buffer 1中孵育2 h，用buffer 1漂洗3×5 min.   在buffer 3 (0.1 mol/L Tris pH 9.5, 0.1 mol/L NaCl, 0.05 mol/L MgCl2)中平衡5 min，在含有0.33 g/L NBT、0.16 g/L BCIP的buffer 3中孵育显色，直到获得预期的杂交信号，用TE中止反应，在950 mL/L乙醇中漂洗1 h，以去除非特异本底. 用水漂洗，去除可能的TE结晶. 在乙醇系列及甲苯中脱水，封片后，用光学显微镜观察结果.

　　2结果和讨论

　　2.1固定时间对杂交信号的影响多聚甲醛通过共价交联氨基基团而固定组织，从而防止mRNA丢失［2, 3］. 因此，固定强度对获得优化的杂交信号有重要影响. 为了研究固定时间对杂交结果的确切作用，我们比较了切片在含有40 g/L多聚甲醛的PBS液中4℃分别固定10, 30和60 min后对杂交结果的影响. 反应过程如材料和方法部分所述. Fig 1显示，固定10 min的海马结构中检测到较弱的杂交信号（Fig 1A），但在固定30 min和60 min的海马切片上检测到很强的杂交信号（Fig  1B, C）. 结果看来，30 min的固定时间已能获得足够满意的信号.A: 10 min;  B: 30 min; C:  60 min. Bar:  100  μm.

　　2.2碱性固定对杂交信号的影响碱性固定能通过促进RNA和蛋白质在高pH值环境固定过程中变性，提高RNA探针与靶分子的可接近性而显著增强杂交信号［3］. 在固定时间得到优化后，我们比较了碱性固定对杂交信号的影响. 切片分别在含有40 g/L多聚甲醛的pH分别为7.5, 8.5, 9.5的PBS液中4℃固定30 min，然后按上述方法进行检测. Fig 2显示，3种固定液对杂交结果无明显影响. 相反也有研究认为［4］，用酸性液固定能增强杂交信号. 因此，固定液的pH值对杂交信号到底有何影响很难有明确结论. 它也许取决于不同的组织类型及不同的杂交反应体系.

　　2.3Triton X100打孔及蛋白酶K消化对杂交信号的影响Triton X100打孔或蛋白酶K轻微消化能促进探针对组织切片的穿透性从而增强杂交信号. 为了验证这些影响，切片固定后用1 mL/L Triton X100或蛋白酶K消化30 min，并按上述方法检测. Fig 3表明，Triton X100和蛋白酶K作用后均导致组织切片形态保存受损且杂交信号下降. 因此，在随后的标准实验程序中，切片不再进行Triton X100和蛋白酶K处理.
　　2.4杂交缓冲液对杂交信号的影响我们还比较了不同的杂交缓冲液对杂交信号的影响. 3种缓冲液分别为：  Yeast RNA杂交液（DEPCtreated 5×SSC, 500 mL/L formamide, 250 mg/L bakers yeast RNA, 50g/L dextran, 0.2 g/L RNase free BSA）, Salmon sperm DNA杂交液（5×SSC，500 mL/L formamide, Salmon sperm DNA 40 mg/L），Denhardts杂交液. 反应过程同上所述. 用3种杂交液获得相同的杂交结果. Fig 4显示的是切片经含有40 g/L多聚甲醛的pH为7.5 的PBS液中4℃固定30 min，用Yeast RNA杂交液，按上述反应程序所得试验结果. Fig  4A, B分别为反义RNA探针、正义RNA探针杂交后的结果. 反义RNA探针检测到清晰的杂交信号. 而作为阴性对照的正义RNA探针杂交后，仅有由内源性碱性磷酸酶作用而产生的微弱本底. 该结果证实我们所得方法的有效性.

　　【参考文献】

　　［1］  Morris RG, Arends MJ, Bishop PE, et al. Sensitivity of digoxigenin and biotinlabeled probes for detection of human papilloma virus by in situ hybridization ［J］. J Clin Pathol, 1990; 43: 800-805.

　　［2］ DeRyckere D, DeGregori J. Identification and characterization of transcription factor target genes using genetargeted mice ［J］. Methods, 2002; 26:  57-75.

　　［3］ Basyuk E, Bertrand E, Journot L. Alkaline fixation drastically improves the signals of in situ hybridization ［J］. Nucleic Acids Res, 2000; 28(10): 46-48.

　　［4］ Braissant O, Wahli W. A simplified in situ hybridization protocol using nonradioactively labeled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections  ［J］.  Biochemica, 1998; 1: 10-16.
　　
　　基金项目：国家留学基金资助项目（22861010）

　　通讯作者：李生斌. Tel. (029)82655474Email. shbinlee@mail.xjtu.edu.dn

　　作者简介：武永飞（1970），男（汉族），陕西省佳县人. 博士生(导师李生斌). Tel. （029）85394864Email. wuyongfei@hotmail.com

　　(1西安交通大学卫生部法医学重点实验室，陕西 西安  710061，   2Department of Cell Biology, Neurobiology &  Anatomy, University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, Ohio 45267, USA)

　　编辑何扬举