原位杂交技术是一种在组织或细胞中定位特定核酸序列的分子生物学方法，广泛应用于基因表达分析、染色体定位和病原体检测等领域。其基本流程包括杂交前准备、杂交、杂交后处理、信号显示及结果分析。以下详细阐述各步骤的关键要点。

一、固定
固定的目的是保持细胞形态，最大限度地保存DNA或RNA，并使探针易于进入细胞。DNA较稳定，而mRNA易被酶降解，因此取材后应尽快冷冻或固定。常用固定剂包括：
1. 多聚甲醛：最常用，不会与蛋白质广泛交联，不影响探针穿透。
2. 醋酸-酒精混合液和Bouin's固定剂：也能获得满意效果。
3. 对于mRNA定位，组织可固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中1-2小时，然后浸入15%蔗糖溶液，4℃过夜，次日切片或液氮保存。
4. 组织也可直接液氮冷冻，切片后浸入4%多聚甲醛约10分钟，空气干燥后-70℃保存。石蜡包埋切片因蛋白质交联增加，探针穿透性较差，杂交信号常低于冰冻切片。

二、玻片和组织切片的处理
1. 玻片处理：载玻片和盖玻片需用热肥皂水刷洗，清洁液浸泡24小时，95%酒精浸泡后蒸馏水冲洗，150℃以上烘烤过夜以去除RNA酶。盖玻片最好硅化处理。常用粘附剂包括铬矾明胶液、多聚赖氨酸液和APES，其中APES粘附效果好且价格适中。
2. 增强组织通透性：使用稀释酸、去垢剂（如Triton X-100）、酒精或消化酶（如蛋白酶K、胃蛋白酶）处理，可提高探针穿透性，但需控制用量以保持组织形态。蛋白酶K常用1 μg/ml（0.1 mol/L Tris/50 mmol/L EDTA，pH8.0），37℃孵育15-20分钟。甘氨酸可终止蛋白酶K作用。胃蛋白酶20-100 μg/ml（0.1 N HCl）37℃消化30分钟效果更佳。消化后常用4%多聚甲醛再固定。
3. 减低背景染色：多聚甲醛固定后浸入乙酸酐和三乙醇胺可减低静电效应。预杂交（不含探针和硫酸葡聚糖）可封闭非特异性位点。杂交后洗涤中可用低浓度RNA酶溶液（20 μg/ml）洗涤一次。
4. 防止RNA酶污染：全程戴消毒手套，玻璃器皿和镊子需240℃烘烤过夜。

三、杂交
将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化盖玻片或无菌蜡膜，防止蒸发。可在盖玻片周围加液体石蜡或橡皮泥封固。将载玻片置于含少量5×SSC或2×SSC的湿盒中孵育。

四、杂交后处理
包括系列不同浓度、不同温度的盐溶液漂洗，以去除非特异性结合的探针。RNA探针背景染色较高，可通过杂交后洗涤有效减低。原则是盐溶液浓度由高到低，温度由低到高。漂洗过程中切勿使切片干燥。

五、显示
根据探针标记物选择放射自显影或酶检测系统显色。放射自显影可用人工或计算机辅助图像分析检测银粒数量。非放射性探针可用酶显色后通过显微分光光度计或图像分析仪进行半定量测定。半定量需严格控制实验条件，如切片厚度、核酸保存量及核乳胶膜厚度等。

六、对照实验和结果判断
常用对照包括：
1. 预杂交吸收试验。
2. 与非特异性载体或不相关探针杂交（置换试验）。
3. RNA酶或DNA酶预处理后杂交。
4. 使用同义RNA探针（Sense probe）杂交。
5. 不加探针的空白试验。
6. 已知阳性或阴性组织对照。
7. 未标记探针竞争杂交。