原位杂交（In Situ Hybridization, ISH）是一种利用标记的核酸探针，在组织切片、细胞涂片及染色体制片上对核酸进行定性、定位和相对定量分析的分子生物学方法。该技术具有灵敏度高、特异性强、直观等优点，广泛应用于肿瘤生物学、血液病理学、遗传学、微生物学、细胞和分子生物学、神经内分泌学、免疫学等领域，以及治疗评估和预后判断。菌落原位杂交是其中一种常见形式，通过将转化或感染后的菌落印迹在滤膜上，经碱裂解、中和、洗净烘干后，用放射性标记的DNA或mRNA探针进行杂交和放射自显影，以筛选阳性克隆。

荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH）是原位杂交技术的重要分支，其探针由荧光物质直接或间接标记。该技术于20世纪80年代末发明，现已从实验室逐步进入临床诊断领域。其基本原理是：荧光标记的核酸探针与变性后的靶核酸在退火温度下复性，通过荧光显微镜观察信号，在不破坏样本原位结构的前提下对靶核酸进行分析。DNA荧光标记探针是最常用的类型，可用于组织、细胞或染色体中的DNA分析。美国Vysis公司是FISH领域的知名企业，提供包括荧光标记探针、杂交试剂、检测试剂、杂交仪器、观察分析仪器及软件在内的全套产品。

荧光标记探针具有环境友好、灵敏度高、可多色分析等优点，允许同时使用多个探针，缩短实验周期。Vysis公司的直接法标记探针无需信号放大系统，减少了试剂投入，提高了特异性，且信号清晰、背景低、操作简便。

附录：核酸分子杂交的类型

核酸分子杂交按作用环境分为固相杂交和液相杂交。固相杂交将一条核酸链固定在固体支持物（如硝酸纤维素膜、尼龙膜、磁珠等）上，另一条游离在溶液中；液相杂交中两条核酸链均游离。固相杂交因易于去除未杂交片段、检测方便且能防止靶DNA自我复性而更为常用。常见固相杂交类型包括：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。液相杂交虽研究最早，但因杂交后去除过量探针困难且误差较高，应用不如固相杂交普遍。近年来，随着检测技术的改进和商业诊断试剂盒的应用，液相杂交技术得到了快速发展。

（一）固相膜核酸分子杂交方法

1. DNA变性：DNA变性解链是杂交成功的关键。Southern印迹杂交时，将凝胶浸入1.5 mol/L NaCl和0.5 mol/L NaOH中1小时，然后用1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）和1.5 mol/L NaCl中和1小时。碱变性可避免DNA降解，热变性需在低DNA浓度（100 μg/ml）和低盐浓度（0.1×SSC）下进行。变性后DNA的OD260增加约30%～40%，醇沉淀呈雪样。

2. DNA固定：硝酸纤维素膜（孔径0.45 μm）先在蒸馏水中浸泡，再用6×SSC浸泡30分钟至2小时，晾干。DNA转移后，室温干燥4小时，80℃真空干燥2小时。

3. 预杂交：将湿润滤膜放入塑料袋，按每平方厘米加0.2 ml预杂交液（6×SSC、0.5% SDS、5×Denhardt液、100 μg/ml变性鲑鱼精DNA），68℃水浴保温3～12小时。

4. 杂交：挤净预杂交液，加入杂交液（6×SSC、0.01 mol/L EDTA、变性标记探针、5×Denhardt液、0.5% SDS、100 μg/ml变性鲑鱼精DNA），68℃杂交4～20小时。

5. 洗膜：取出滤膜，依次用2×SSC/0.5% SDS室温漂洗5分钟，2×SSC/0.1% SDS室温洗涤15分钟，0.1×SSC/0.5% SDS 68℃洗涤2小时（中间换液一次）。洗膜温度应低于Tm值12℃以上（Tm = 69.3 + 0.41×(G+C)%）。

6. 结果显示：放射性检测可采用放射自显影或液闪计数。放射自显影将杂交膜与X光片在暗盒中曝光，-20℃或-80℃下进行可减弱32P散射。液闪计数适用于打点和狭缝杂交，将膜剪成小块，加入闪烁液后计数。