细胞冻存与复苏是细胞生物学实验中的基本技术，正确操作可确保细胞活性和功能。以下为详细步骤：

一、冻存方法

1. 细胞准备：选择对数生长期的细胞，收集前24小时换液一次，以保证细胞状态最佳。

2. 计数与离心：常规方法制备细胞悬液，计数，调整细胞密度至5×10⁶/ml，离心去上清。

3. 冻存液配制：以培养液9份加DMSO 1份（或甘油）配成10% DMSO冻存液。逐滴加入离心管中，轻轻吹打重悬细胞。

4. 分装：将细胞悬液分装入无菌安瓿或冻存管，每管1.5 ml。

5. 封口与标记：塑料冻存管拧紧瓶口；火焰封口安瓿需检查密封性，可浸入蓝色液中观察。为安全起见，将安瓿缝入纱布袋中，系线绳并标记细胞名称和冻存日期。

二、复苏方法

1. 从液氮罐中取出安瓿或冻存管，注意防护（护目镜和手套），防止因液氮气化爆炸。

2. 迅速放入36-37℃水浴中，不时摇动，尽快解冻（1-2分钟内完成）。

3. 取出安瓿，用70%酒精擦拭消毒，在超净台内打开，吸出细胞悬液至离心管，补加10 ml培养液，吹打混匀。

4. 低速离心（500-1000转/分）5分钟，弃上清，重复漂洗一次。

5. 加入适量培养液重悬，移入培养瓶，置37℃、5% CO₂培养箱培养。次日更换培养液，继续培养。

三、冻存液与DMSO溶液配制

冻存液：60 ml RPMI1640或DMEM，40 ml无γ球蛋白马血清（或胎牛血清），1 ml青霉素-链霉素。0.2 μm滤膜过滤，分装后-20℃长期保存，短期可4℃保存。

20% DMSO溶液（使用当天新鲜配制）：若用100% DMSO，取4 ml pH调节的培养基（橙红色），加1 ml无菌100% DMSO和0.1 ml versene，0.2 μm滤膜过滤。若用50% DMSO，取3 ml pH调节的培养基，加2 ml 50% DMSO和0.1 ml versene，过滤。注意：versene可省略，但加入可防止细胞聚集。

注意事项：所有溶液预冷，操作在冰上进行；DMSO需缓慢逐滴加入并混匀；复苏时快速解冻可减少冰晶损伤；离心速度不宜过高，避免损伤细胞。