PCR污染与对策

PCR反应的最大特点是具有较大的扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。

污染原因

（一）标本间交叉污染：标本污染主要有以下几种情况：

• 收集标本的容器被污染；
• 标本放置时，由于密封不严导致溢出或容器外粘有标本，造成相互间交叉污染；
• 标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；
• 某些微生物标本（尤其是病毒）可随气溶胶扩散，导致彼此间的污染。

（二）PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，加样枪、容器、双蒸水及其他溶液被PCR核酸模板污染。

（三）PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要、最常见的污染问题。PCR产物的拷贝量通常很大（一般为10¹³拷贝/ml），远远高于PCR检测数个拷贝的极限，因此极微量的PCR产物污染即可造成假阳性。特别是气溶胶污染是一个容易被忽视但可能性较大的污染源。

（四）实验室中克隆质粒的污染：在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也较为常见。克隆质粒在单位容积内含量较高，且在纯化过程中需要使用较多的用具及试剂，污染的可能性较大。

污染的监测

一个好的实验室应时刻注意污染的监测，及时发现污染原因并采取措施加以防止和消除。

1. 阳性对照：在建立PCR反应实验室及一般检验单位时，应设有PCR阳性对照。阳性对照是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否符合理论要求的重要参考标志。阳性对照的选择应以扩增度中等、重复性好的样品为主，避免使用高浓度阳性样品以减少污染风险。

2. 阴性对照：每次PCR实验务必设置阴性对照，包括标本对照和试剂对照，以监测是否存在污染。

3. 重复性试验：通过重复实验验证结果的可靠性。

4. 选择不同区域的引物进行PCR扩增：通过设计不同区域的引物进行扩增，排除污染的可能性。

防止污染的方法

一、污染的预防

进行PCR操作时，操作人员应严格遵守操作规程，最大程度地降低PCR污染的可能性。

（一）划分操作区：将实验操作分为三个不同的区域：

• 标本处理区：包括扩增模板的制备；
• PCR扩增区：包括反应液的配制和PCR扩增；
• 产物分析区：包括凝胶电泳分析、产物拍照及重组克隆的制备。

各工作区应有一定的隔离，操作器材专用，避免交叉污染。

（二）分装试剂：PCR扩增所需试剂应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台内配制和分装。所有的加样器和吸头需专用，避免交叉污染。

（三）实验操作注意事项：

• 操作时戴一次性手套，避免污染；
• 使用一次性吸头，避免吸头长时间暴露于空气中；
• 避免反应液飞溅，开盖前稍离心收集液体于管底；
• 操作时设立阴阳性对照和空白对照；
• 尽可能使用可替换或可高压处理的加样器，避免交叉污染。

二、污染的追踪

如果发生污染，应从以下几方面逐一分析并排除污染：

• 设立阴阳性对照，监测反应体系各成分的污染情况；
• 检查环境污染源，包括实验设备、实验台面、空气等。

三、污染的处理

（一）环境污染的处理：

• 稀酸处理法：用1mol/L盐酸擦拭或浸泡可疑器具；
• 紫外照射法：使用254/300nm波长的紫外线照射30分钟，但需注意其对短片段DNA效果有限。

（二）反应液污染的处理：

• DNase I法：在PCR混合液中加入DNase I进行处理；
• 内切酶法：选择识别特定序列的内切酶处理；
• 紫外照射法：对未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外照射；
• γ射线辐射法：利用γ射线破坏污染的DNA。

（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法：通过在PCR产物或引物中用dU代替dT，并用UNG处理去除污染。

（四）固相捕获法：利用生物素标记的探针与污染核酸杂交，通过链霉亲和素的固相载体捕获并去除污染物。

（五）RS-PCR法：设计链特异性引物以降低假阳性。

（六）抗污染引物法：通过设计特定引物，避免扩增污染的DNA。

通过上述方法，可以有效预防和处理PCR污染问题，从而提高实验结果的准确性和可靠性。