越来越多的研究人员开始采用小分子干扰RNA（small interfering RNAs，siRNAs）来抑制特定的哺乳动物基因表达。siRNA是一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰途径（RNA interference pathway）。RNAi的应用包括功能基因组学、药物靶筛选、细胞信号传导通路分析等。

目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括：

1. 化学合成

2. 体外转录

3. 长片段dsRNAs经RNase III类降解（如Dicer, E. coli, RNase III）

4. siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs

5. PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达

前三种方法包括体外制备siRNAs然后经过转染或者电转导入哺乳动物细胞，后两种方法则依赖能够表达siRNAs的DNA载体或者表达框转染到细胞中。每种方法都有自己的优点和缺点。哪种是最好的方法，其实取决于实验目的。

siRNA的设计

除了方法3以外，其他的方法都在制备siRNA前都需要单独设计siRNA序列。关于怎样设计siRNA以及siRNA设计对siRNA功能的影响，尽管我们不断掌握越来越多有关设计原则的信息，但这仍然不是精确的。通常来说，每个目标序列设计3-4对siRNAs，在后面的实验中选择最有效的那个。网上有提供免费的siRNA设计工具。

体外制备

1. 化学合成

尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的——研究人员几乎不需要做什么工作。包括Ambion和Qiagen公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高、定制周期长，特别是特殊需求。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3-4对siRNAs的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。

最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究。

不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素。

Figure 2. Use of Chemically Synthesized and in Vitro Transcribed siRNAs to Induce Gene Silencing. siRNAs targeting β-Actin were prepared by chemical synthesis (Ambion) or by in vitro transcription using Ambion's Silencer siRNA Construction Kit. HeLa cells were plated at 30,000 cells per well in a 24 well tissue culture plate containing glass slides. The cells were transfected 24 hours after plating, using 2 µl siPORT Lipid (Ambion) according to the manufacturer's protocol, at a final siRNA concentration of 75 nM. Immunofluorescence analysis was performed 96 hr post transfection using mouse anti-Human β-Actin primary antibody and a FITC conjugated anti-mouse IgG secondary antibody. Photographs were taken using the appropriate fluorescent filters and quantified using MetaMorph software. Note that both siRNA preparation methods resulted in > 95% reduction in β-actin protein levels.

2. 体外转录

通过体外转录的方法可以合成siRNAs，这样的成本相对化学合成法而言比较低，是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法。更重要的是采用这种方法能够比化学合成法更快的得到siRNAs。以Silencer siRNA Construction Kit为例，一旦得到DNA Oligo模板（这个还是需要DNA合成的，不过DNA合成的成本就比较低了），只要24小时就可以，不需要等很久。这个方法的不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。

最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。

不适用于：实验需要大量的一个特定的siRNA，长期研究。

体内表达

前面的3种方法主要都是体外制备siRNAs，并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转到细胞内。而采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则属于：从转染到细胞的DNA模板中在体内转录得到siRNAs。这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。

4. siRNA表达载体

多数的siRNA表达载体依赖3种RNA聚合酶III启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。这3类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。

最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞。长期研究。

不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。

Figure 4. Long Term Silencing of GFP with pSilencer 2.1-U6 hygro. HeLa cells expressing cycle 3 GFP were transfected with pSilencer 2.1-U6 hygro containing an insert encoding an siRNA targeting cycle 3 GFP or pSilencer 2.1-U6 hygro without an siRNA-encoding insert. Following transfection, the cells were selected with hygromycin. Three weeks following selection, the cells were analyzed for GFP expression by fluorescence microscopy. Green: GFP. Blue: DAPI stained nuclei. GFP levels were remarkably reduced (94%) in cells transfected with the GFP siRNA-encoding pSilencer 2.1-U6 hygro siRNA Expression Vector as compared to those transfected with an "empty" siRNA expression vector.

5. siRNA表达框架

siRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模板，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。这个方法最早是由Castanotto和其同事采用，包括一个RNA pol III启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不用一天的时间。

最适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子。

不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了）。

Figure 5. Variable Reduction in Target Gene Expression Using SECs with Different Promoters. siRNA Expression Cassettes featuring the mouse U6 (Mo-U6), human U6 (Hu-U6), and human H1 (Hu-H1) promoters and encoding a c-fos-specific hairpin siRNA were transfected into HeLa cells. 72 hours post-transfection, the cells were assessed using nuclear staining with DAPI and immunofluorescence using a c-FOS antibody. Non-transfected cells (NT) as well as cells transfected with an SEC expressing a negative control siRNA (scramble) demonstrate wild-type levels of c-FOS. The relative level of reduction in gene expression was quantified and is provided in the bar graph.

运用RNAi来诱导基因表达的沉默是一种制备基因功能缺失表型的有效的新方法。下表总结了5种不同的制备siRNA的方法。